аспирантка кафедры патологической анатомии (ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздрава России)
врач-патологоанатом (ООО Национальный центр клинической морфологической диагностики)
студентка 3-го курса медико-профилактического факультета (ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздрава России)
научный сотрудник лаборатории морфологии и патологии опорно-двигательного аппарата (Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»)
кандидат медицинских наук; доцент кафедры пропедевтики внутренних болезней (ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздрава России)
кандидат медицинских наук; доцент кафедры внутренних болезней, нефрологии, общей и клинической фармакологии с курсом фармации (ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздрава России)
кандидат медицинских наук, доцент; первый заместитель директора (Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) – это многофакторные состояния с генетической предрасположенностью, которые развиваются в ответ на действие инфекционного, аллергического агентов, компонентов микробиоты [1, 2]. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) вместе с синдромом раздраженного кишечника (СРК) являются состояниями, которые существенно влияют на качество жизни пациентов. Подтверждено наличие иммунологического нарушения кишечного барьера [2], а также различия механизмов повреждения и заживления слизистой оболочки [3]. ВЗК характеризуются отсутствием однозначно установленных этиологических факторов, сложностью патоморфогенеза, недостатком морфологических дифференциально-диагностических критериев [2, 3].
Патморфологический диагноз БК и ЯК верифицируется на основе определения клинических и гистологических (сегментарность поражения, язвы, наличие крипт-абсцессов, гранулемы, лимфоидные узелки, инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами и т.д.) [2–17]. При этом данных об особенностях распределения воспалительных и иммунокомпетентных клеток в разные фазы течения ВЗК недостаточно, несмотря на то, что они важны для понимания этиопатогенеза, прогнозирования течения и диагностики.
Цель исследования – определить клеточный состав воспалительного инфильтрата собственной соединительнотканной пластинки слизистой оболочки кишки при ВЗК и синдроме раздраженного кишечника.
Исследование одобрено этическим комитетом СЗГМУ им. И.И. Мечникова (протокол № 9 от 06.10.2021) и проведено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 года, пересмотр октябрь 2013года (1964г.). От всех пациентов получено добровольное информированное согласие на проведение исследования.
Материалом исследования послужили мультифокальные щипковые биоптаты слизистой оболочки всех отделов кишечника от пациентов с БК, ЯК в стадии обострения и ремиссии, а также пациентов с СРК (группа сравнения) (n=75). Критерии включения: мужчины и женщины в возрасте 18–75 лет с клиническим диагнозом «болезнь Крона», «язвенный колит» и «синдром раздраженного кишечника». Критерии исключения из исследования: злокачественный опухолевый процесс в кишечнике, выявленные кишечные инфекции, сопутствующие соматические заболевания в стадии декомпенсации.
Биоптаты слизистой оболочки подвздошной, восходящей ободочной, сигмовидной, прямой кишки, полученные при колоноскопии, фиксировали в нейтральном формалине, подвергли стандартной гистологической обработке (фиксация, проводка, изготовление парафиновых блоков (n=300), депарафинизация, регидратация, изготовление срезов). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. На втором этапе исследования ручным методом иммуногистохимически выявили позитивно окрашенные в реакциях с антителами к CD163 (MRQ-26, мышиные моноклональные антитела/IgG, Dako, США), CD3 (MRQ-39, кроличьи моноклональные антитела/IgG1 Dako, США), CD20 (L26, мышиные моноклональные антитела/IgG, Dako, США), CD138/syndecan-1 (B-A38, кроличьи моноклональные антитела/IgG, Dako, США), CD117 (104D2D1, моноклональные мышиные антитела/IgG1 Dako, США) антигены у 15 пациентов с диагнозом «воспалительное заболевание кишечника» и «синдром раздраженного кишечника». Постановку реакций осуществляли согласно рекомендациям фирм-производителей антител. Ядра докрашивали гематоксилином Майера («Абрис+», Россия) [18].
На изготовленных препаратах при ×400 подсчитывали число нейтрофилов, эозинофилов, число клеток с положительной реакцией с антителами к CD163, CD3, CD20, CD138, CD117 по полям зрения (микроскоп Leica DM3000, Leica Mircosystems, Германия) с пересчетом на 1 мм2 собственной пластинки слизистой оболочки кишки, в 12 наиболее репрезентативных участках. При морфометрии элементы лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, в анализ не включали.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием системы IBM SPSS Statistics 26.0, США; оценивали нормальность распределения, определяли меры центральных тенденций и разброса (медиана, межквартильный интервал). Количественные показатели с распределением, отличающимся от нормального, представлены как Me (Q1; Q3). Значимость различий между двумя изучаемыми группами для количественных переменных оценивали с помощью непараметрического критерия U Манна–Уитни, между тремя и более – с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллеса. Снижали влияние ошибки первого рода при проведении попарных межгрупповых сравнений с помощью поправки Бонферрони; далее для попарных сравнений использовали U Манна–Уитни. Критерий Спирмена использовали для корреляционного анализа, р<0,05 (*) и р<0,01(**).
В подгруппах ЯК в стадии ремиссии, БК в стадии ремиссии и обострения преобладали мужчины, в группе СРК и ЯК в стадии обострения –женщины. Средний возраст в группе обострения для ЯК составил 45±15 лет для женщин, 41±16 лет для мужчин, для БК – 48±14 лет и 41±16 лет, в группе ремиссии для ЯК – 46±23 года и 47±18 лет, для БК – 53±15 лет и 52±16 лет, в группе сравнения (СРК) – 43±16 лет и 31±6 лет. Статистически значимые различия по полу и возрасту не выявлены, р>0,05.
Диагнозы установлены на основании общепринятых клинических, эндоскопических, рентгенологических и патогистологических критериев [19–21]. По тяжести течения в группе обострения преобладала среднетяжелая форма, умеренная эндоскопическая активность, в группе ремиссии и СРК преобладала норма (отсутствие активности по шкале Riley). При обострении и ремиссии язвенного колита чаще отмечали дистальное поражение (50 и 79%), реже панколит (47 и 21%), терминальный илеит в 3% при ЯК в стадии обострения. При БК отмечали дистальное поражение при обострении и ремиссии (27 и 32%), панколит в 62 и в 47% случаев, проксимальное поражение в 12 и в 21%.
При ВЗК, как правило, число CD3+ Т-лимфоцитов, плазмоцитов меньше, чем при СРК, а макрофагов (при болезни Крона в стадии обострения) и тучных клеток (при язвенном колите в стадии обострения) больше (табл. 1). В-лимфоциты распределены в виде скоплений при СРК и ВЗК (рис. 1).
Наблюдалась тенденция к меньшему числу CD3+ Т-лимфоцитов у пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона в стадии ремиссии по сравнению с числом клеток при СРК, что было статистически значимо при БК; CD138+ плазмоцитов было меньше у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом. Характерным признаком ВЗК является эозинофильная инфильтрация. Наибольшее число CD163+ макрофагов и CD117+ тучных клеток наблюдали при язвенном колите в стадиях ремиссии и обострения (табл. 2). Иногда встречались гранулемы при БК в стадии обострения (рис. 2).
Уровень нейтрофильной и эозинофильной инфильтрации был выше во всех группах ВЗК по сравнению с группой СРК; наибольшие показатели отмечены у пациентов с язвенным колитом в стадии обострения (табл. 3). Число CD3+ Т-лимфоцитов было ниже при язвенном колите и болезни Крона в стадии ремиссии по сравнению с числом лимфоцитов при СРК; число CD138+ клеток меньше при язвенном колите в стадии обострения (табл. 3). Макрофагов больше во всех группах ВЗК, особенно при болезни Крона в стадии обострения (табл. 3, рис. 3, 4). CD117+ тучных клеток больше при язвенном колите в стадии обострения по сравнению с числом тучных клеток при болезни Крона в стадии обострения, р<0,05.
Уровень нейтрофильной и эозинофильной инфильтрации (рис. 5 А, В) выше у пациентов с ВЗК по сравнению с пациентами группы сравнения, при обострении по сравнению с пациентами с ремиссией (табл. 4).
В отличие от других локализаций, определены статистически значимо более высокие уровни CD3+ Т-лимфоцитов, CD138+ плазмоцитов при болезни Крона и язвенном колите в стадии обострения (рис. 5 D, E) (табл. 4).
Макрофагов (рис. 5 F) больше в группах ВЗК по сравнению с группой СРК, а также при язвенном колите в стадии ремиссии по сравнению с болезнью Крона в стадии ремиссии. Наибольших значений их доля достигает при язвенном колите в стадии обострения, что статистически значимо выше по сравнению с болезнью Крона. При язвенном колите в стадии обострения (рис. 5 С) тучных клеток больше, чем при ремиссии (табл. 4). Число В-лимфоцитов (CD20+) клеток не отличалось в группах ВЗК и СРК, достигало 20–160 на 1 мм2 или 570–1880 мм2 при очаговом скоплении, но статистически значимые различия не были выявлены, что связано с расположением В-лимфоцитов преимущественно в пределах узелков, которые характеризуются неравномерным распределением.
Отмечали положительную корреляционную связь между числом CD20+, CD138+ клетками с CD163+ макрофагами в проксимальных отделах кишечника при БК как в стадии ремиссии (r=0,77; p<0,05), так и в стадии обострения (r=0,88; p<0,05). При ЯК число корреляционных связей оказалось минимальным, а именно между CD3+ и CD20+ (r= –0,9 p<0,05) в сигмовидной кишке, между CD163+ и CD3+ (r= –0,72, p<0,01) в прямой кишке.
Состав клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки (СПСОК) вариабелен, связан c различием этиопатогенеза воспалительных заболеваний кишечника [3]. В нашем исследовании клеточная инфильтрация была больше выражена в дистальных отделах кишечника, что может быть обусловлено бактериальной обсемененностью и воспалением преимущественно сигмовидной и прямой кишки при БК и ЯК [3, 12, 13]. При СРК инфильтрация CD3+ клетками в восходящей ободочной кишке оказалась больше в 4 раза, чем при БК в стадии ремиссии, и меньше в прямой кишке (при ЯК в стадия обострения в 3 раза и ремиссии в 3,75 раза). Лимфоплазмоцитарная инфильтрация является нормальным компонентом собственной пластинки слизистой оболочки кишки, при СРК она больше, чем в норме [22]; снижение при БК в стадии ремиссии связано, вероятно, с иммуносупрессивной терапией. Установлено, что медиаторы, секретируемые Т-лимфоцитами, обеспечивают коммуникацию иммунных и стромальных клеток, могут приводить как к усилению воспаления, вызывая повреждение слизистой оболочки кишки, так и к его уменьшению, обеспечивая процесс регенерации [3, 6, 7, 10, 11, 14, 19]. В целом, увеличение инфильтрации слизистой оболочки кишки при обострении и ассоциация с ними указывают на их участие в патогенезе ВЗК. СПСОК в норме содержит эозинофилы и единичные нейтрофилы. Полученные нами результаты коррелируют с данными литературы [21]. Нейтрофильная и эозинофильная инфильтрация собственной соединительнотканной пластинки слизистой оболочки дистальных отделов кишечника выше при ЯК в стадии обострения по сравнению СРК, ЯК в стадии ремиссии, БК в стадии обострения и представляет собой первую линию защиты слизистой оболочки кишечника от антигенов [19]. Контролируемое увеличение числа нейтрофилов способствует удалению поврежденных клеток, тканей и привлечению в очаг воспаления макрофагов [3, 6, 7, 10, 11, 14, 19]. При ВЗК в собственной пластинке слизистой оболочки кишки отмечали больше макрофагов, чем при СРК, что может быть связано как с воспалением в стадии обострения, так и с регенерацией в стадии ремиссии. Число макрофагов было больше при БК в стадии обострения в подвздошной, сигмовидной, прямой кишке, а при ЯК (обострение) – в прямой кишке, что соответствует наиболее частой локализации патологического процесса. Не только увеличение числа макрофагов, но и изменение их поляризации (на воспалительные (М1); ранозаживляющие (М2)) является характерной чертой ВЗК, а именно БК [19]. Число тучных клеток при ЯК больше чем при БК в стадии обострения в восходящей ободочной и сигмовидной кишках [3, 6, 7, 10, 11, 14, 19], что является типичной чертой для ЯК в стадии обострения, преимущественно при локализации в толстой кишке.
Несмотря на преобладание пациентов с тотальным поражением кишечника, наиболее выраженные изменения наблюдали в дистальных отделах: в сигмовидной кишке при БК и прямой кишке при ЯК. С учетом этого подсчет клеток инфильтрата в собственной пластинке слизистой обоснован в сигмовидной и прямой кишке, но должен включать не только определение наличия криптитов и крипт-абсцессов, а также других компонентов. Данные литературы по числу клеток инфильтрата, таких как лимфоциты, плазмоциты, тучные клетки, крайне противоречивы. Вероятно, это связано с разными методиками выявления и большим субпопуляционным разнообразием клеток [23].
Число макрофагов при БК статистически значимо коррелирует с числом В-лимфоцитов, плазмоцитов в подвздошной кишке, что говорит о присутствии гуморального компонента в патогенезе данной нозологии. При ЯК, несмотря на большое количество клеток инфильтрата, число корреляционных связей минимально – это может указывать на избыточное, неконтролируемое воспаление. Минимальное число корреляционных связей при БК в стадии ремиссии можно рассматривать как следствие иммуносупрессивной терапии. Двойственность клеток инфильтрата, которые участвуют как в воспалении, так и в регенерации имеет большое знаечние. Также не стоит забывать о частом несоответствии эндоскопической и морфологической ремиссии.
Клеточный состав инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки кишки при воспалительных заболеваниях кишечника вариабелен, зависит от локализации, нозологии, фазы течения болезни. Несмотря на эти различия, основными эффекторами воспаления при язвенном колите являются нейтрофилы, эозинофилы, тучные клетки, число которых нарастает в дистальном направлении; при болезни Крона – макрофаги в проксимальных отделах кишечника. Тем не менее морфологическое исследование биоптатов сегодня является сложной задачей в связи с отсутствием однозначных критериев и определенных знаний о региональных различиях как в норме, так и при воспалительных заболеваниях кишечника, поэтому на данный момент не включает подсчет клеток инфильтрата, но является перспективным направлением в будущем.