Введение

Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) представляют собой гетерогенную группу опухолей системы крови, которые характеризуются первичным заселением костного мозга морфологически незрелыми кроветворными опухолевыми клетками, экспрессирующими миелоидные антигены, и инфильтрацией ими разных органов с клинико-лабораторными проявлениями синдрома костномозговой недостаточности. Частота выявления ОМЛ составляет 3–5 случаев на 100 000 взрослых, однако увеличивается до 15–20 случаев на 100 000 в возрасте старше 60 лет и вносит существенный вклад в заболеваемость и смертность. Установлено, что ОМЛ возникает из лейкозных стволовых клеток (ЛСК), которые являются основоположниками клона бластов. Мутации, приобретенные ЛСК с течением времени, могут привести к клональной экспансии в костном мозге при отсутствии каких-либо клинических проявлений, что характеризуется как клональный гемопоэз. В последующем эти клетки могут приобретать дополнительные мутации, трансформирующие их в злокачественные, что приводит к развитию ОМЛ. Последовательное приобретение мутаций на разчных этапах заболевания, в том числе на доклинической стадии, обусловливает значительную клональную гетерогенность ОМЛ у большинства взрослых [1–3].

Цель исследования – провести профилирование мутационного статуса опухолевых клеток у пациентов с острым миелобластным лейкозом с созреванием с использованием метода высокопроизводительного секвенирования.

Материалы и методы

Работа представляет собой ретроспективное исследование. Проведен анализ вариантов генетических повреждений в зависимости от морфологического подтипа лейкоза. Всего за период с 2020 по 2023 год в Свердловский областной гематологический центр госпитализировано 24 пациента, страдающих ОМЛ, которым проводилась молекулярно-генетическая диагностика с использованием метода высокопроизводительного секвенирования (NGS). Из них были отобраны 10 пациентов с острым миелобластным лейкозом с созреванием (ОМЛ М2), которым в полном объеме выполнены цитологический анализ крови и костного мозга, цитохимическое, иммунофенотипическое и цитогенетическое исследование [4]. Все пациенты перед исследованием подписывали добровольное информированное согласие. Средний возраст исследуемых (семь женщин и трое мужчин) составил 58,7 года.

Молекулярно-генетическое исследование включало определение методом полимеразной цепной реакции транскриптов химерных генов t(6;9)(p23;q34)/ DEK-NUP214, t(8;21)(q22;q22)/ RUNX1-RUNX1T1, t(9;11)(p22;q23)/ MLLT3-MLL, t(9;22)(q34;q11.2)/ BCR-ABL1, t(15;17)(q22;q12)/ PML-RARA, inv(16)(p13.1q22)/ CBFB-MYH11. Методом фрагментного анализа осуществляли детекцию внутренних тандемных дупликаций и нуклеотидных замен в позиции D835, кодирующей последовательности тирозинкиназного домена в гене FLT3, инсерций в гене NPM1 [4–6]. Выявление мутаций в 141 гене осуществляли методом NGS на автоматическом анализаторе MiSeqDX (Illumina, США) с использованием диагностической панели QIAseq Targeted DNA Human Myeloid Neoplasms Panel (Qiagen, США). Клиническую значимость обнаруженных генных мутаций оценивали согласно классификации AMP/ACMG/ASCO/CAP для соматических вариантов [7].

Все этапы исследования соответствовали законодательству Российской Федерации и нормативным документам исследовательских организаций, а также были одобрены локальным этическим комитетом Института медицинских клеточных технологий (протокол заседания № 2/15 от 17.07.2015).

Статистическую обработку результатов проводили, исходя из гипотезы о биномиальном распределении генетических событий, рассчитывали математическое ожидание и доверительные интервалы (ДИ) на основе оценки параметров с вероятностью 95%.

Результаты

Наиболее частым вариантом цитогенетических аномалий в исследуемой группе пациентов были специфические хромосомные мутации, ассоциированные с благоприятным прогнозом ОМЛ (n=3, 30,0%, при 95% ДИ от 10,8% до 60,3%). Во всех наблюдениях они были представлены транслокацией t(8;21)(q22;q22) (рис.), при этом методом ПЦР был выявлен транскрипт химерного гена RUNX1-RUNX1T1, средний уровень его относительной экспрессии соответствовал 568,0%. Диплоидный кариотип лейкозных клеток определялся в пяти случаях (50,0%, при 95% ДИ от 23,7% до 76,3%). Также выявлено по одному случаю ОМЛ М2 со специфической транслокацией t(9;22)(q34;q11.2) и неспецифическими количественными хромосомными аберрациями +11 и +mar (по 10,0%, при 95% ДИ от 1,8% до 40,4%). В образце с транслокацией t(9;22)(q34;q11.2) обнаруживался транскрипт химерного гена BCR-ABL1, уровень его относительной экспрессии составлял 21,9%.

Методом фрагментного анализа в четырех случаях (40,0%, при 95% ДИ от 16,8% до 68,7%) обнаруживались мутации в гене FLT3. Наряду с FLT3 ITD в трех образцах выявлены инсерции в гене NPM1. Средние уровни аллельной нагрузки при этом составили 0,60 для мутантного FLT3 и 0,80 для NPM1, соответственно.

Значимые для онкогенеза ОМЛ генные мутации были выявлены методом высокопроизводительного секвенирования во всех пробах. Среднее количество выявленных генных мутаций составило 2,9±0,9 на исследованный образец. Среднее количество генных мутаций у пациентов с нормальным кариотипом составило 4,0±1,1, у пациентов со специфическими хромосомными транслокациями t(8;21)(q22;q22) и t(9;22)(q34;q11.2) – 1,5±0,6. В наибольшем числе проб методом NGS выявлялись мутации в генах FLT3 и DNMT3A (n=4), по три наблюдения – мутации в генах RUNX1, IDH2 и NPM1, по два – ASXL1, TET2, SRSF. Мутации в генах CEBPA, NRAS, WT1, CHEK2, BCOR, ATM встречались в единичных пробах.

В целом, среднее количество генетических аномалий, выявленных всеми использованными методами, составило 3,6±0,7 на пробу. Оно было минимальным при ОМЛ с t(8;21)(q22;q22) и дупликацией c. 1934dupG в гене ASXL1 и ОМЛ с диплоидией и генными мутациями IDH2 c. 515G>A и RUNX1 c.614-1 G>C, возраст пациентов составил 18 и 48 лет, соответственно. В обоих случаях указанные мутации приводили к трансляции усеченной полипептидной цепи. Максимальное количество генетических аномалий (n=5) определялось у трех пациентов в возрасте 58, 69 и 80 лет. В первом случае они были представлены количественными аномалиями кариотипа +11, +mar в сочетании с мутациями в генах DNMT3A, IDH2 и SRSF. Во втором и третьем случаях при нормальном кариотипе бластов определялось по пять мутаций в генах DNMT3A, FLT3, NPM1, TET2, WT1 и ASXL1, CEBPA, IDH2, RUNX1, SRSF. Другими словами, у пациентов со специфическими хромосомными транслокациями t(8;21)(q22;q22) и t(9;22)(q34;q11.2) среднее количество генетических поломок, выявленных всеми использованными методами, составило 2,8±0,5 на пробу, что может свидетельствовать в пользу того, что в данной подгруппе для развития ОМЛ необходимо меньшее число молекулярных событий.

Выявленные комбинации генных и хромосомных мутаций имели некоторую специфику в разных подгруппах ОМЛ. Так, при ОМЛ с t(8;21) (q22;q22) в каждой из исследованных проб определялись различные генные мутации, в том числе NRAS c.34 G>A, ASXL1 c.1934 dupG и трансверсия RUNX1 c.1184 C>A в сочетании с FLT3 ITD (по одному наблюдению). При ОМЛ с диплоидией, как правило, одновременно выявлялись мутации в генах транскрипционных факторов и эпигенетических регуляторов: RUNX1 в сочетании с IDH2, RUNX1 и CEBPA в сочетании с ASXL1 и IDH2, FLT3 в сочетании с NPM1, DNMT3A и/или ТЕТ2. Мутации других классов встречались реже.

Обсуждение

Использование технологий секвенирования позволило принципиально улучшить понимание молекулярных основ лейкомогенеза, однако частота ОМЛ взрослых, при которой использование химиотерапии эффективно для индукции и поддержания устойчивой ремиссии, не превышает 30–40% [8–10]. Соответственно, наиболее оптимальной лечебной стратегией для большинства пациентов является аллогенная трансплантация костного мозга. Применение таргетных лекарственных препаратов в сочетании с трансплантацией или в монорежиме у пациентов, имеющих к ней противопоказания, является активно исследуемой терапевтической опцией, напрямую связанной с генотипированием ОМЛ [11–13].

В представленном исследовании среднее количество выявленных генетических аномалий составило 3,6 на пробу, из них с использованием технологии NGS – 2,9 на пробу. У пациентов с нормальным кариотипом дополнительно определялось от двух до пяти генных мутаций, что позволило уточнить у них прогноз, хотя это не предусмотрено действующими федеральными клиническими рекомендациями для ОМЛ, в основу которых положены прогностические критерии European LeukemiaNet 2017 [14]. При этом в 2022 году группой международных экспертов были предложены новая классификация и прогностическая модель ОМЛ, включающие дополнительные генетические подгруппы, часть из которых является составными. Соответственно, при оценке вариантов исходов ОМЛ предусматривается интерпретация данных, полученных в том числе методом NGS, с использованием онлайн-калькулятора [1, 15].

В соответствии с моделью [15] у шести пациентов из исследуемой выборки, несмотря на выявление методом NGS генных мутаций, прогноз оставался неизменным: в трех случаях благоприятным, в двух промежуточным, в одном неблагоприятным. В одном наблюдении при ОМЛ М2 с хромосомными аберрациями +11, +mar и трех наблюдениях с нормальным кариотипом в бластах обнаруживались дополнительные мутации, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом. Соответственно, прогноз заболевания менялся с промежуточного на неблагоприятный. Таким образом, лишь в четырех случаях (40,0%, при 95% ДИ от 23,7% до 76,3%) исследование мутационного профиля методом NGS позволило скорректировать оценку прогноза ОМЛ.

Цитогенетические исследования и молекулярное типирование конкретных генетических панелей при ОМЛ до настоящего времени являются наиболее распространенными методами, которые широко используются в практической онкогематологии. Тем не менее, применение NGS, которое, вероятно, в ближайшее время станет рутинным диагностическим тестом, будет не столько потенциальной заменой, сколько дополнительной опцией к морфологическим, цитогенетическим и ПЦР-тестам, обеспечивающей комплексное типирование ОМЛ. Соответственно, пациенты, имеющие уточненные профили генных мутаций, являются потенциальными кандидатами на специфические методы лечения, которые могут варьировать от стандартной химиотерапии и трансплантации костного мозга до включения в клинические исследования новых таргетных препаратов [12–15].

Заключение

Патогенетически значимые генные мутации выявлены методом высокопроизводительного секвенирования во всех пробах аспиратов костного мозга пациентов с острым миелобластным лейкозом с созреванием. Среднее количество выявленных в опухолевых клетках генетических аномалий составило 3,6 на пробу, в том числе с использованием технологии секвенирования – 2,9 на пробу.

Наибольшее клиническое значение применение секвенирования имело при

лейкозах с нормальным кариотипом бластов и случайными хромосомными аберрациями, при которых на основе анализа дополнительно выявленных генных мутаций был уточнен прогноз заболевания. Напротив, при остром миелобластном лейкозе с созреванием, ассоциированном со специфическими хромосомными аномалиями, а также мутациями в гене NPM1 в сочетании с дупликациями FLT3 прогноз не изменялся, несмотря на выявление в пробах дополнительных мутаций.