младший научный сотрудник Научно-исследовательского института вирусологии, аспирантка Института молекулярной патологии и патоморфологии (ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
научный сотрудник лаборатории исследования вирусных заболеваний растений и животных Научно-исследовательского института экспериментальной и клинической медицины (ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
кандидат медицинских наук; врач клинической лабораторной диагностики, заведующая научно- клиническим диагностическим центром (ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
доктор медицинских наук, профессор; директор (ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Пандемия COVID-19 дала большой массив материала для исследования процессов, происходящих в организме при вирусных инфекциях. При изучении показателей крови пациентов с COVID-19 обнаруживались лейкопения, лимфоцитоз и нейтрофилия, которые были ассоциированы с более клинически тяжелым течением заболевания [1–4]. Проведение световой микроскопии мазков крови пациентов с COVID-19 по различным показаниям позволило обнаружить изменение морфологии лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов [5, 6]. Были выявлены выраженные изменения формы ядер и структуры хроматина лейкоцитов, множественные аномальные формы ядер нейтрофилов, токсическая зернистость нейтрофилов [6–10], атипичные лимфоциты [11, 12]. При этом анализ литературы демонстрирует отсутствие специфических для SARS-CoV-2 морфологических изменений клеток крови. Обнаружено долгосрочное воздействие COVID-19 на систему кроветворения: наблюдавшиеся изменения морфологии клеток крови сохранялись в течение 7 месяцев [7]. У людей, переживших острый этап коронавирусной инфекции, риск смерти в последующие 6 месяцев повышается на 60% в сравнении с людьми из группы, не переболевшими коронавирусной инфекцией [13].
Целью нашего исследования было изучение состава и морфологии лейкоцитов в периферической крови пациентов с вирусной COVID-19 пневмонией и поиск корреляций с неблагоприятным исходом (в том числе в отдаленном периоде: через год после госпитализации).
Объектом исследования являются образцы мазков периферической крови, взятых у пациентов в первый день госпитализации в рамках стандартных диагностических процедур. Участие пациентов в исследовании было основано на их информированном добровольном согласии. Пациенты имели основной диагноз «новая коронавирусная инфекция COVID-19» (U07.1 по МКБ-10) и находились на лечении в городской клинической больнице № 11 (Новосибирск) в период с марта по ноябрь 2021 года.
Мы проанализировали клиническую информацию о 252 пациентах (возраст, пол, исход заболевания). Все пациенты были распределены в группы в соответствии с исходом: группа 1 – летальный исход в больнице; группа 2 – летальный исход в течение одного года после госпитализации; группа 3 – выжившие в течение одного года после госпитализации. Информация о выживаемости пациентов взята из базы данных единой государственной информационной системы в сфере здравоохранения (ЕГИСЗ). Работа была согласована с комитетом по биомедицинской этике при ФИЦ ФТМ (протокол № 60 от 17.09.2024). Случайным образом нами были выбраны 28 пациентов в возрасте 53,5±14,4 года. Их мазки крови, рутинно окрашенные в больнице по Романовскому–Гимзе, проанализированы под микроскопом Axio Imager.M2 (Carl Zeiss, Германия) с окуляром ×10 и объективом ×100, подсчитывались не менее 200 клеток на стекло. Программное оборудование для работы с микроскопом – ZEN 3.7 (Carl Zeiss, Германия). Проводился поиск корреляции между морфологическими изменениями лейкоцитов и исходом заболевания. Статистический анализ осуществляли с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США), использовался статистический критерий Манна–Уитни для сравнения двух независимых групп по количественным признакам, критерий Краскела–Уоллиса для сравнения трех независимых групп по количественным признакам, критерий хи-квадрат при анализе таблиц сопряженности качественных признаков. С целью выявления прогностической значимости морфологических признаков был проведен ROC-анализ.
При анализе клинической информации о 252 пациентах нами обнаружено, что более старший возраст ассоциирован с летальным исходом в стационаре или в течение одного года после госпитализации (табл. 1), что соответствует аналогичным результатам других авторов [14].
Мы случайным образом выбрали 28 пациентов для морфологического анализа их мазков крови (табл. 2). Значимые различия по показателям общего анализа крови, взятого в первый день госпитализации, не обнаружены.
Микроскопическое исследование показало, что у пациентов имеются нарушения морфологии клеток всех лейкоцитарных ростков (рис. 1–4). Среди всех типов лейкоцитов были широко представлены как нарушения строения ядра (нарушения сегментации, нарушения формы и размера ядра, гипо- и гиперконденсация хроматина), так и нарушения строения цитоплазмы (цитоплазматическая вакуолизация). Для нейтрофилов были характерны множественные аномальные формы ядер (включая кольцевое ядро, ядра в виде очков), аномалия псевдо-Пельгера-Хьюэта, токсическая зернистость цитоплазмы. Встречались апоптотические клетки, атипичные лимфоциты (большой гранулярный лимфоцит, большой лимфоцит, реактивный лимфоцит), кистевидные ядра у моноцитов, большое количество клеточного детрита – обломков клеток. Кроме того, нами обнаружено появление у пациентов с COVID-19 незрелых лейкоцитарных предшественников (миелобласты, миелоциты, метамиелоциты, пролимфоциты и промонобласты).
Самым распространенным нарушением морфологии лейкоцитов для пациентов с летальным исходом являлся некроз. Такие лейкоциты подвергаются лизису: цитолизу (набухание цитоплазмы, сопровождающееся краевым затемнением цитоплазмы и оттеснением ядра и/или гранул к периферии клетки, а также нарушение целостности цитоплазматической мембраны) и хроматолизу (набухание ядра, нарушение целостности ядерной мембраны). Результаты подсчета доли погибающих лейкоцитов представлены в таблице 3.
Также в образцах мазков крови была оценена доля нейтрофилов, подвергшихся нетозу – специфической клеточной гибели, сопровождающейся энергозависимым выбросом из клетки нитей ДНК и некоторых белков в виде объемного облака, захватывающего и тормозящего собой патогены. У пациентов в группах 1 и 2 доля погибающих путем некроза нейтрофилов выше, чем погибающих нетозом (p=0,000019 и p=0,026519, соответственно).
С целью выявления прогностической значимости некоторых из обнаруженных морфологических признаков был проведен ROC-анализ (табл. 4).
Согласно результатам ROC-анализа, доля нейтрофилов, подвергающихся некрозу, повышалась как в группе тех пациентов, которые умерли в больнице, так и у тех, кто умер в течение одного года после госпитализации, а доля лимфоцитов, подвергающихся некрозу, повышалась в группе тех пациентов, которые умерли в больнице. Таким образом, лизис более 14,6% нейтрофилов является предиктором детального исхода в течение одного года после госпитализации, а сочетание лизиса более 15,0% нейтрофилов с лизисом более 16,1% лимфоцитов –предиктором летального исхода в стационаре. ROC-анализ вклада нетоза в летальный исход не подтвердил значимость этого признака для такого исхода.
Таким образом, у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, происходят разнообразные нарушения морфологии клеток всех лейкоцитарных ростков, включая некроз и нетоз. Насколько нам известно, массивный некроз лейкоцитов при COVID-19 ранее не был описан другими авторами. В то же время нетоз при COVID-19 описан [15].
Некроз лейкоцитов приводит к высвобождению во внеклеточное пространство содержимого клеток и образованию большого количества химически активного клеточного детрита с формированием патологической петли воспаления с положительной обратной связью. Вследствие развития массового некроза лейкоцитов у пациентов мы предполагаем, что использование мембраностабилизаторов при лечении COVID-19 поможет уменьшить лавинообразный лизис клеток и улучшить прогноз.
Существует вероятность того, что часть погибших лейкоцитов, видимых на предметном стекле, могла быть результатом механического воздействия при приготовлении препарата, поскольку лейкоциты предактивированы вирусом SARS-CoV-2, оказавшим свое цитопатическое действие. Тем не менее это обстоятельство не препятствует использованию обнаруженного феномена в качестве диагностического маркера летального исхода у пациентов как во время текущей госпитализации, так и в течение последующего года. Если бы разрушение лейкоцитов имело только вторичный характер, можно было бы ожидать ориентацию «хвостов» из клеточного содержимого исключительно вдоль предметного стекла. Дополнительными аргументами в пользу массовой гибели лейкоцитов у пациента являются активация кроветворения и появление в кровеносном русле клеток-предшественников, что указывает на дефицит лейкоцитов. Косвенным подтверждением массового некроза лейкоцитов и попадания внутриклеточного содержимого в кровеносное русло считается также цитокиновый шторм, часто регистрируемый у пациентов с тяжелым течением COVID-19.
Недостатками нашего исследования можно назвать небольшую выборку и отсутствие слепого контроля.
При инфицировании SARS-CoV-2 происходит нарушение морфологии клеток всех лейкоцитарных ростков, включающее как массовую гибель клеток и появление клеточного детрита в крови, так и наличие незрелых лейкоцитарных предшественников. На базе ROC-анализа установлены диагностические пороги для показателей доли погибающих некрозом нейтрофилов и лимфоцитов как прогностического фактора летального исхода в больнице или в отдаленном периоде (в течение года после госпитализации), поэтому морфологический анализ лейкоцитов в мазке периферической крови, взятом у пациента с COVID-19 в первый день госпитализации, при увеличении объектива ×100 может быть использован для уточнения краткосрочного и долгосрочного прогноза и коррекции тактики лечения. Данный метод не требует специального оборудования, кроме микроскопа.