Введение

Холестаз – застой желчи в результате нарушения ее оттока из печени в двенадцатиперстную кишку. Это осложнение возникает при различных заболеваниях печени и желчевыводящих путей, особенно часто при желчнокаменной болезни [1]. Застой желчи приводит не только к нарушению переваривания (особенно жиров) в кишечнике и энтерогепатической циркуляции желчных кислот, но и к повышенному поступлению компонентов желчи в кровь, что оказывает токсическое воздействие на разные органы и системы, включая головной мозг. В результате развиваются когнитивные и поведенческие нарушения [2].

В клинической практике отмечено, что холемическая интоксикация угнетающе действует на ЦНС. При начальных стадиях холестаза развиваются головные боли, головокружение, тяжесть в голове, нарушения сна, разбитость, апатия. Затем могут проявляться симптомы неврастении, энцефалопатии, энцефаломиелопатии и полинейропатии [2]. Крысы с холестазом хуже справляются с прохождением водного лабиринта Морриса, у них отмечаются пассивность и нарушение памяти узнавания [3]. При продолжении холестаза в головном мозге развиваются разнообразные морфологические нарушения: повреждение и гибель корковых нейронов, особенно их митохондрий [2].

Поясная кора относится к лимбической системе и является переходной между филогенетически новой (неокортекс, изокортекс) и старой корой (палеокортекс, аллокортекс). Она принимает участие в выполнении когнитивных функций: отвечает за эмоции, обучение и память [4].

В наших предварительных исследованиях при экспериментальном холестазе у крыс обнаружены значительные изменения числа, размеров и формы нейронов поясной коры [5]. Представляло интерес выяснение нарушений молекулярных маркеров энергетического метаболизма нейронов поясной коры, которые могут лежать в основе их гибели при холестазе.

АТФ-синтаза – это интегральный белок внутренней мембраны митохондрий, обеспечивающий ее складчатость и синтез большей части АТФ в клетке [6, 7]. Нарушения АТФ-синтазы является причиной многих метаболических расстройств [8] и нейродегенеративных заболеваний [9, 10]. Известно, что нейроны – это клетки с высоким уровнем энергопотребления. Они используют АТФ для поддержания ионных градиентов через мембрану, что критически важно для генерации нервных импульсов и синаптической передачи. АТФ необходим нейронам для процессов, связанных с обучением и памятью, роста и ремоделирования синапсов [11].

Целью настоящей работы была качественная и количественная иммуногистохимическая оценка изменений содержания АТФ-синтазы в нейронах поясной коры мозга крыс при подпеченочном холестазе.

Материалы и методы

Число животных в эксперименте – 220 (самцы беспородных белых крыс массой 225±25 граммов). Гибель животных от холестаза 67,2%. Наибольшая смертность наблюдалась на 3–5-е сутки и на 21–25-е сутки после операции; после 30-х суток животные не погибали. В работе использованы 72 выжившие беспородные белые крысы-самцы (по шесть животных в шести опытных и шести контрольных группах). Животных контрольных и опытных групп содержали в стандартных условиях вивария, в индивидуальных клетках со свободным доступом к воде и полноценной пище. Исследование проведено в соответствии с принципами биоэтики и требованиями директивы Европейского парламента и совета № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, используемых для научных целей [12]. На проведение данного исследования получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 11.01.2024).

Для моделирования подпеченочного холестаза перерезали общий желчный проток (ОЖП) между двумя лигатурами на 2–3 мм ниже места слияния печеночных протоков по методу Л.С. Кизюкевича [13]. Перевязка/перерезка ОЖП выше этого уровня может не приводить к полному холестазу, а ниже в него впадают многочисленные протоки поджелудочной железы, перевязка которых приводит к развитию панкреатита и быстрой гибели всех животных [14]. Крысам контрольных групп проводили ложную операцию с сохранением физиологического оттока желчи в двенадцатиперстную кишку на протяжении всего эксперимента. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 суток в утренние часы животных опытных и контрольных групп синхронно выводили из эксперимента путем декапитации, предварительно усыпив парами эфира. Для исследования брали кусочки больших полушарий головного мозга, фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [15] при температуре +4ºС, затем заключали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовили с помощью микротома Leica RM 2125 RTS (Leica Microsystems, Германия) и монтировали на предметные стекла. Срезы обрабатывали согласно протоколу иммуноцитохимической реакции для световой микроскопии без теплового демаскирования антигенов.

Для выявления АТФ-синтазы применяли первичные моноклональные мышиные антитела Anti-ATP5A antibody (Abcam, Великобритания, каталожный номер ab. 14748) в разведении 1:2400 (выбрано как оптимальное) при +4ºС, экспозиция 20 часов, во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Mouse and Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit (Abcam, Великобритания, каталожный номер ab. 80436).

Для идентификации поясной коры головного мозга крыс использовали схемы стереотаксического атласа [16]. Гистологические препараты изучали, фотографировали и анализировали с помощью микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), встроенной цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems, Германия), а также программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). Цитофотометрию нейронов проводили в мелкоклеточном и крупноклеточном слоях поясной коры [17]. Для оценки содержания АТФ-синтазы определяли оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме нейронов мелкоклеточного и крупноклеточного слоев поясной коры на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакции и выражали в единицах оптической плотности (после вычитания фона). В каждом случае оценивали не менее 30 клеток при увеличении микроскопа ×40.

В результате морфометрических исследований получены количественные непрерывные данные. Их обрабатывали с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер AXAR207F394425FA-Q) с применением описательной статистики. Так как в эксперименте нами использовались выборки, которые не всегда имели нормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики. Для каждого показателя определяли значение медианы (Me), значение нижнего квартиля (LQ), значение верхнего квартиля (UQ) и интерквартильного диапазона (IQR). Объекты исследования набирали в группы независимо друг от друга, поэтому сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна–Уитни для независимых выборок. Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (p<0,05; где р – критическое значение уровня значимости) [18].

Результаты

В нейронах мелкоклеточного слоя поясной коры животных контрольных групп при иммуногистохимической окраске на АТФ-синтазу кроме гомогенной окраски цитоплазмы выявлялись иммунопозитивные гранулы, ядра нейронов не окрашивались. При холестазе окраска цитоплазмы нейронов была слабее, а зернистость выявлялась хуже (рис. 1).

При этом иммунореактивность АТФ-синтазы в цитоплазме нейронов мелкоклеточного слоя поясной коры через двое суток после перевязки/перерезки ОЖП уменьшалась на 6,5% (р=0,0012), на 5-е сутки на 13,3% (р=0,0001). Наибольшее снижение наблюдалось на 10-е сутки (22,6%) (р=0,0001). На более поздних сроках холестаза снижение было менее выражено: на 20-е сутки – 6,7% (p=0,0209) и на 45-е сутки – 9,7% (р=0,0001) по сравнению с контрольной группой этих же сроков. На 90-е сутки холестаза данный показатель не отличался показателей от контроля (табл. 1).

В крупноклеточном слое поясной коры в цитоплазме нейронов контрольных животных наблюдалось равномерное распределение АТФ-синтазы иммунопозитивных гранул, соответствующее представлениям о расположении и размерах митохондрий, при этом ядра нейронов оставались неокрашенными. В опытной группе иммунопозитивная окраска цитоплазмы нейронов была заметно бледнее, гранулы почти не выявлялись (рис. 2).

Содержание АТФ-синтазы в цитоплазме нейронов крупноклеточного слоя на 2-е и 5-е сутки холестаза после перевязки/перерезки ОЖП уменьшалось на 8,8% (р=0,0013) и 11,8% (р=0,0001). Это снижение достигало максимума на 10-е (14,7%) (р=0,0001) и на 20-е сутки (15,1%) (р=0,0001). На 45-е сутки оно составляло 9,1% (р=0,0011), а на 90-е данный показатель не отличался от контроля (табл. 2).

Обсуждение

В цитоплазме нейронов поясной коры, окрашенных на выявление АТФ-синтазы, скопления гранул были сосредоточены в перинуклеарной области и соответствовали представлениям о нахождении и размерах митохондрий. Это объясняется расположением АТФ-синтазы на внутренней мембране митохондрий.

У животных с холестазом происходит снижение содержания АТФ-синтазы в цитоплазме нейронов второго, мелкоклеточного, и пятого, крупноклеточного, слоев поясной коры, что указывает на снижение образования АТФ в митохондриях, это может приводить к нарушению энергетического метаболизма и функций нейронов. При этом снижение содержания данного маркера начинается уже на 2-е сутки после перевязки/перерезки ОЖП, достигает минимума на 10–20-е сутки, а затем постепенно нормализуется к 90-м суткам. Динамика этих изменений АТФ-синтазы после перерезки ОЖП полностью соответствует результатам биохимических исследований, полученных нами ранее, отражающим тяжесть холестаза [2]. По результатам биохимического анализа крови животных пик холестаза (содержание билирубина, холестерина и желчных кислот) в наших экспериментах приходится на 10–20-е сутки после операции, и именно в этот период нами было выявлено наибольшее снижение содержания АТФ-синтазы в нейронах поясной коры. Известно, что накопление желчных кислот в крови является одним из наиболее вероятных механизмов повреждения клеток во время холестаза [19]. В более ранних наших исследованиях было установлено, что нейроны теменной и лобной коры реагируют на холестаз схожим образом. В отдаленные сроки (45–90-е сутки после перерезки ОЖП) все исследуемые показатели приходят к контрольным значениям, что, вероятно, связано с устранением холестаза, а именно с прорастанием у выживших крыс к 20-м суткам после операции обходных желчевыводящих протоков и восстановлением оттока желчи в двенадцатиперстную кишку [2].

Выявленные изменения содержания АТФ-синтазы, по-видимому, обусловлены процессом адаптациии выживших нейронов к холестазу. Известно, что после травмы клетки могут переходить в состояние энергетической экономии, снижая потребность в АТФ и, соответственно, количество АТФ-синтазы [20]. Такие органы как мозг особо чувствительны к низким уровням АТФ, его снижение может привести к повреждению и гибели нейронов [21]. Вместе с тем хронический дефицит АТФ может активировать пути клеточной смерти, такие как апоптоз или некроз [22], что и было выявлено нами в более ранних исследованиях [5]. Возвращение уровня АТФ-синтазы к норме на 90-е сутки может указывать на восстановление нормальной функции и энергетического баланса в выживших нейронах. В целом, это отражает высокие адаптационные возможности нейронов поясной коры мозга крыс.

Заключение

Нейроны поясной коры крыс реагируют на холестаз снижением содержания АТФ-синтазы, что может приводить к уменьшению образования АТФ в митохондриях и нарушению энергетического обеспечения нейронов и, как следствие, ухудшению их функций и гибели. Это снижение начинается на 2-е сутки после перерезки общего желчного протока, достигает максимума на 10-е и 20-е сутки (пик холестаза), а затем постепенно нормализуется в сохранившихся нейронах у выживших животных к 90-м суткам (по мере устранения холестаза).

Снижение АТФ-синтазы в нейронах поясной коры при подпеченочном холестазе может лежать в основе нарушений энергетического метаболизма, повреждения и гибели этих нейронов, развития нейропсихических расстройств при данной патологии.