ассистент кафедры патологической анатомии (ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава России)
доктор биологических наук; руководитель центра коллективного пользования экспериментальной онкологии (ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава России)
ассистент кафедры патологической анатомии (ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава России)
доктор медицинских наук, профессор; заведующая кафедрой патологической анатомии (ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
В первично-множественных злокачественных новообразованиях, в состав которых входил светлоклеточный почечно-клеточный рак G3, G4, наблюдалось уменьшение реакции на HIF-1α по сравнению с первично-множественными злокачественными новообразованиями, включающими высокодифференцированный почечно-клеточный рак (G1, G2), и нарастание по сравнению с одиночным почечно-клеточным раком. При этом в ацинарной аденокарциноме предстательной железы изменения в уровне HIF-1α не обнаружены.
Гипоксией индуцируемый фактор 1 (HIF-1) активирует транскрипцию генов, которые участвуют в важнейших аспектах регуляции жизнедеятельности злокачественных клеток, включая ангиогенез, пролиферацию, метаболизм глюкозы, апоптоз и аутофагию, уклонение от эффекторного воздействия иммунной системы, развитие резистентности к химотерапии, активацию опухолевых стволовых клеток. Внутриопухолевая гипоксия и генетические изменения могут приводить к повышению уровня HIF-1, который коррелирует с повышенной смертностью пациентов при различных вариантах злокачественных новообразований. Гипоксия способствует апоптозу как в нормальных, так и в опухолевых клетках [1]. Однако гипоксические условия в микроокружении опухоли наряду с накоплением генетических изменений (мутаций) часто способствуют избыточной продукции HIF-1 [2].
HIF-1 состоит из регулируемой кислородом альфа-субъединицы (HIF-1α) и конститутивно экспрессируемой бета-субъединицы ARNT (HIF-1β). Стабильность HIF-1α, а также активность транскрипции зависят от уровня кислорода. Альфа-субъединица образует гетеродимер с бета-субъединицей [2].
Недавние достижения позволили изучить центральную роль HIF-1α в развитии и прогрессировании рака предстательной железы (РПЖ). В метаанализе, проведенном M.И. Huang et al. (2018), исследована связь повышения уровня HIF-1α с прогрессированием рака предстательной железы. Уровень выявления белка HIF-1α в РПЖ был значительно выше, чем в незлокачественных тканях предстательной железы. Авторы считают, что иммуногистохимическое выявление HIF-1α является потенциально диагностическим биомаркером РПЖ и может быть применено для неинвазивного мониторинга прогрессирования РП у пациентов [3].
В отличие от многих типов опухолей HIF-1α оказывает противоположный эффект на морфогенез светлоклеточного почечно-клеточного рака (ПКР), действуя как опухолевый супрессор [4].
Цель исследования – провести сравнительный анализ уровня гипоксией индуцируемого фактора 1 (HIF-1) в гистологических образцах светлоклеточного почечно-клеточного рака и ацинарной аденокарциномы предстательной железы, входящих в состав первично-множественных злокачественных новообразований (ПМЗН) и одиночных злокачественных новообразований (ОЗН) данных локализаций.
Исследование проведено с использованием архивных образцов биопсии пациентов, находившихся на стационарном лечении в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского в период 2012–2020 годов. Все исследуемые биопсийные образцы были морфологически верифицированы. Пациенты разделены на три исследуемые группы.
В первую группу вошли пациенты с ПМЗН почки и предстательной железы. Основанием для включения в указанную группу послужили следующие критерии.
Опухоли относятся к разной гистологической группе. Исключена вероятность метастазов первичной опухоли.
Морфологический тип опухоли почки представлен светлоклеточным почечно-клеточным раком предстательной железы – ацинарной аденокарциномой.
Пациенту ранее не проводилось лечение онкологических заболеваний (для исключения лечебного патоморфоза опухолей).
В две группы сравнения были включены пациенты с одиночными опухолями предстательной железы (вторая группа) и почки (третья группа) с соблюдением следующих условий.
1. Опухоль является первичным одиночным злокачественным новообразованием с исключенным лечебным патоморфозом в анамнезе.
2. Морфологический тип одиночных опухолей совпадает с морфологическим типом ПМЗН.
Для дифференцировки синхронности и метахронности развития ПМЗН применялись правила в соответствии с классификацией IACR/IARC (International Agency for Research on Cancer), которые предполагают диагностику синхронных опухолей, диагностированных в интервале менее 6 месяцев (или метахронных – более 6 месяцев), если они локализуются в разных анатомических областях [5].
Материал опухолей предстательной железы и почки исследовался тотально, опухоль преимущественно располагалась в периферических отделах предстательной железы и почки, для иммуногистохимического исследования выбраны участки с сохранными опухолевыми узлами, где находились жизнеспособные опухолевые клетки.
Гистологические срезы толщиной 4 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, исследованы при помощи светового микроскопа Leica DM1000 (Leica, Германия) и микровизора проходящего света µVizo-103 (АО «ЛОМО», Россия).
Для оценки количественных показателей опухолевой ткани проводилась цифровая фотосъемка (цифровая камера для микроскопа C-mex-10 pro, ООО «МедТехникаПоинт», Россия) гистологических препаратов. Полученные фотографии импортировались в электронный анализатор изображения – программу ImageView 2.5.2 (США), с помощью которой проводились фотофиксация всей площади среза и измерение морфометрических показателей в микрометрах. Измерения опухолевых клеток включали в себя длину и ширину ядра, длину и ширину клетки, площадь ядра, площадь клетки, площадь цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое отношение, количество клеток с вакуолизированной цитоплазмой.
Для иммуногистохимического исследования использовали антитела HIF-1α (Arg575-Asn826) и ARNT Ab (DF6154) (табл. 1). Окрашивание проводили при помощи мультимерной безбиотиновой системы детекции REVEAL – Biotin-Free Polyvalent DAB (Spring Bioscience Corp., США). Для оценки специфичности иммунного окрашивания в каждом случае проводили отрицательный контроль (обработка срезов вместо первичных антител неиммунным буфером), результатом чего было отсутствие специфического иммунного окрашивания.
Оценку иммуногистохимической реакции HIF-1α и ARNT проводили в соответствии со стандартной методикой для данных маркеров, описанной Kim C.M. et al. [6]. На срезах с ИГХ окрашиванием подсчитывали средний процент клеток c реакцией маркера в 30 полях зрения. Реакцию на HIF-1α и ARNT оценивали полуколичественно по следующей схеме оценки: 0 –отрицательная; + (<10% клеток с реакцией) – слабая; ++ (10–50% клеток с реакцией) – умеренная; +++ (>50% клеток с реакцией) – выраженная [6].
Данное исследование было проведено с использованием иммуногихимических методик идентификации маркеров HIF-1α и ARNT. Флуоресцентная гибридизация
Полученные данные были подвергнуты статистической обработке в программном обеспечении SPSS 17.0 (SPSS: An IBM Company. США). Нормальность распределения признаков в группах определяли с помощью критерия Шапиро‒Уилка. Распределение признаков не соответствовало нормальному, поэтому для оценки наличия статистически значимых отличий использовался непараметрический критерий Манна–Уитни (U-тест). Количественные данные описывались посредством медианы, минимального и максимального значений, 1-го и 3-го квартилей. В исследовании была проведена коррекция на множественное сравнение Бонферрони. Статистически значимым считался результат, если вероятность отвергнуть нулевую гипотезу об отсутствии различий не превышала 0,833% (р<0,00833).
Дизайн исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского Минздрава России (протокол № 7 от 01.02.2022).
За период 2012–2020 годов выявлено 58 случаев ПМЗН с поражением почки и предстательной железы. Синхронное развитие отмечалось у восьми пациентов (8,6%), метахронное – у 50 (91,4%).
Возрастное распределение пациентов с ПМЗН почки и предстательной железы на момент постановки диагноза показало, что превалирующим контингентом являются лица в возрасте от 60 до 70 лет – 27 человек (46,6%). Средний возраст составил 68 лет.
Принято, что для каждой опухоли в составе ПМЗН (в данном случае рак почки – рак предстательной железы) стадия определяется самостоятельно [7]. Таким образом, все случаи были разделены на три подгруппы. Первую подгруппу составили 23 пациента (40,8%) с локализованными стадиями по системе TNM: I–I, I–II, II–II; во вторую подгруппу вошли 25 пациентов (42,2%) с местно-распространенными стадиями по TNM I–III, II–III, III–III; третью подгруппу составили 10 пациентов (17%) с запущенным, диссеминированным опухолевым процессом – стадии по TNM I–IV, II–IV, III–IV, IV–IV.
У 43 пациентов в комбинации рак почки – рак предстательной железы первично развивался рак почки, затем рак предстательной железы. Обе опухоли при данной последовательности возникновения диагностировались преимущественно на стадиях Т1–Т2.
При первичном развитии рака в предстательной железе (15 пациентов) было отмечено, что новообразование диагностировалось с одинаковой частотой на разных стадиях опухолевого процесса, тогда как рак почки, выявленный впоследствии, выявлялся, как правило, на стадиях Т1–Т2.
При сравнении морфометрических характеристик ПМЗН предстательной железы и почки с единичными опухолями тех же локализаций было выявлено уменьшение всех исследуемых параметров опухолевых клеток. В опухолях предстательной железы при ПМЗН уменьшались следующие показатели: площадь клетки – в 1,25 раза, ядра – в 1,2 раза, цитоплазмы – в 1,1 раза, количество клеток с вакуолизированной цитоплазмой – в 1,6 раза, количество дву- и многоядерных клеток – в 1,4 раза (табл. 2).
При оценке результатов иммуногистохимического исследования проводилось попарное сравнение уровня реакции на HIF-1α и ARNT в ПМЗН с аналогичной одиночной опухолью.
Уровень цитоплазматичской и ядерной реакции на HIF-1α в ПМЗН преобладал над уровнем реакции на HIF-1α в ОЗН почки и предстательной железы.
Повышение уровня реакции в опухолевых клетках в 2 раза наблюдалось при сочетании светлоклеточного ПКР G1, G2 с ацинарной аденокарциномой предстательной железы 6–7 баллов по шкале Глисона.
В ПМЗН, включающих светлоклеточный ПКР G3–G4, наблюдалось уменьшение реакции на HIF-1α по сравнению с ПМЗН с ПКР G1–G2 и нарастание ядерной реакции по сравнению с одиночным ПКР G3–G4. При этом в ацинарной аденокарциноме предстательной железы изменения в экспрессии HIF-1α не обнаружены (табл. 3, рис. 1 A–D). В группе ПМЗН данный механизм обусловлен снижением уровня реакции HIF-1α в низкодифференцированных формах светлоклеточного ПКР G3-G4.
При сравнении уровня реакции ARNT в группах с ПМЗН и ОЗН выявлено полное отсутствие ядерной реакции в обеих группах, а уровень цитоплазматической реакции не отличался (табл. 4, рис. 1 E–H).
Уменьшение морфометрических показателей в опухолях предстательной железы при ПМЗН может быть обусловлено влиянием опухолевого микроокружения и увеличением количества злокачественных нейроэндокринных клеток, которые отличаются уменьшенными показателями по сравнению с типичными опухолевыми клетками РПЖ. Нейроэндокринные клетки являются андрогеннезависимыми и также способны синтезировать HIF-1α, что ухудшает прогноз для пациента даже с учетом планируемой андрогенкорректирующей терапии [8, 9]. В опухолях почек существенные отличия не обнаружены [10].
Полученные данные уровня иммуногистохимической реакции HIF-1α в одиночных злокачественных новообразованиях почки согласуются с литературными источниками. Повышение уровня реакции в высоко- и умеренно- дифференцированных формах ПКР (G1, G2) и снижение уровня реакции в низкодифференцированных формах (G3,4) свидетельствуют о мутациях в генах, кодирующих синтез данного фактора, который в ПКР играет роль антионкогена [11, 12]. В злокачественных новообразованиях предстательной железы HIF-1α, напротив, является активатором прогрессирования роста опухоли, и повышение реакции наблюдается при нарастании степени злокачественности (низкодифференцированные формы с оценкой по шкале Глисона ≥8) [13].
Повышение уровня реакции в опухолевых клетках ПКР G1, G2 с ацинарной аденокарциномой предстательной железы 6–7 баллов по шкале Глисона в 2 раза обусловлено системным влиянием HIF-1α, продуцируемого опухолевыми клетками почки, на стимуляцию онкогенеза в железистом эпителии предстательной железы.
Снижение степени дифференцировки клеток в группе ПМЗН обусловлено нарушением синтеза биологически активных веществ, в том числе HIF-1α, играющего роль антионкогена в опухолевых клетках почки, однако за счет наличия в организме аденокарциномы предстательной железы иммуногистохимическая реакция HIF-1α возрастала по сравнению таковой при одиночном почечноклеточном раке, где происходило её снижение.
ARNT является конститутивным синтезируемым веществом, связывающим HIF-1α. Этот комплекс импортируется в ядро и активирует транскрипцию широкого спектра генов, направленных на устранение гипоксических условий в ткани. В опухолевых клетках отсутствие ядерной иммуногистохимической реакции данного маркера, но наличие цитоплазматической позволяет судить о присутсвии свободного ARNT в цитоплазме опухолевых клеток, при связывании с HIF-1α он перестает выявляться иммуногистохимически, так как образует комплексное соединение с HIF-1α [14, 15].
Уровень цитоплазматичской и ядерной реакции HIF-1α в первично-множественных злокачественных новообразованиях преобладал над уровнем HIF-1α в одиночных злокачественных новообразованиях почки и предстательной железы. Повышение уровня иммуногистохимической реакции в опухолевых клетках в 2 раза наблюдалось при сочетании светлоклеточного почечно-клеточного рака G1, G2 с ацинарной аденокарциномой предстательной железы 6–7 баллов по шкале Глисона.
В первично-множественных злокачественных новообразованиях, включающих светлоклеточный почечно-клеточный рак G3–G4, наблюдались уменьшение HIF-1α по сравнению с первично-множественными злокачественными новообразованиями с почечно-клеточным раком G1–G2 и нарастание ядерной экспрессии по сравнению с одиночным почечно-клеточным раком G3–G4. При этом в ацинарной аденокарциноме предстательной железы изменения в реакции HIF-1α не обнаружены.