доктор медицинских наук, профессор; заведующий Центром фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России); профессор кафедры офтальмологии (ФГБОУ ВО Российский университет медицины Минздрава России)
кандидат медицинских наук; научный сотрудник отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
кандидат биологических наук; заведующий лабораторией трансплантологии и клеточной биологии Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
аспирант отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
кандидат медицинских наук; заведующая глазным тканевым банком (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
кандидат медицинских наук; научный сотрудник лаборатории трансплантологии и клеточной биологии Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России); ассистент кафедры офтальмологии (ФГБОУ ВО Российский университет медицины Минздрава России)
младший научный сотрудник лаборатории трансплантологии и клеточной биологии Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
кандидат медицинских наук; научный сотрудник отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза (ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Идиопатическая эпиретинальная мембрана (иЭРМ) – заболевание, обусловленное развитием фиброглиальной пролиферации на поверхности сетчатки в области центральной ямки. Распространенность иЭРМ в популяции составляет 9,1% [1]. иЭРМ представляет собой многослойную структуру. Наружный слой расположен непосредственно на внутренней пограничной мембране (ВПМ) сетчатки и состоит из белков внеклеточного матрикса (ВКМ). Над ним расположен внутренний слой, представленный одним или несколькими слоями клеток [2]. По мере развития иЭРМ происходит накопление миофибробластоподобных клеток, что повышает сократительные свойства мембраны. Сокращение иЭРМ приводит к повреждению внутренних слоев сетчатки, обусловливая снижение остроты зрения и развитие искажений (метаморфопсий) у пациентов с данной патологией [2].
Микроинвазивная трехпортовая витрэктомия c удалением иЭРМ и ВПМ является основным методом лечения данного заболевания. Удаление ВПМ выполняется следующим этапом после удаления иЭРМ. Тем не менее в ряде случаев выраженная адгезия компонентов иЭРМ к ВПМ позволяет удалить такие мембраны только единым блоком [3].
Изучение морфологического строения иЭРМ необходимо для углубления понимания патогенетических механизмов и оптимизации лечебной тактики в отношении пациентов с данным заболеванием. Ранее в работе группы авторов было дано патоморфологическое обоснование целесообразности хирургии по поводу иЭРМ на ранних сроках заболевания, так как по мере его прогрессирования нарастает трансформация клеточного состава иЭРМ в миофибробластоподобные клетки с последующим сокращением мембраны и снижением у пациентов зрительных функций [3].
Морфологические характеристики иЭРМ широко представлены в литературе, однако основное число публикаций посвящено различным типам клеточных образований, выявленных в удаленных образцах мембран [4–6]. ВКМ мембран, напротив, изучен гораздо менее детально. Небольшое число исследований, представленных в литературе на данную тему, несет лишь описательный характер, указывает на наличие в составе ВКМ коллагенов, протеогликанов [7, 8]. В литературе на сегодняшний день не представлено сведений о характере взаимодействия структур ВКМ между собой, а также о взаимосвязи данных структур с ВПМ сетчатки при формировании иЭРМ.
Необходимо отметить, что стандартный метод забора и фиксации образцов мембран, удаленных с поверхности сетчатки, позволяет выявить наличие искомых антигенов, но не дает возможности визуализировать пространственные взаимоотношения между компонентами удаленных мембран. При этом морфология ВПМ при формировании иЭРМ изучена наименее детально, что объясняется рядом причин. Во-первых, при стандартном методе фиксации мембран для иммуногистохимического исследования поиск и идентификация ВПМ в составе иЭРМ затруднительны из-за малых размеров ВПМ. Во-вторых, отсутствие специфических маркеров к структурным компонентам ВПМ осложняет процесс их иммуногистохимического выявления в иЭРМ. Наиболее часто применяемым маркером для окрашивания ВПМ является ламинин [9–11]. Однако использование антитела ко всем изоформам ламинина при изучении комплекса иЭРМ + ВПМ не позволяет достоверно выявить ВПМ в составе образца, так как установлена иммунореактивность ламинина 1 + 2, ламинина α5, ламинина β1 и ламинина γ1 с ВКМ эпиретинальных мембран. Были предложены более специфичные маркеры ВПМ, такие как ламинин 111 [12], ламинин 521 [13] и ламинин β2 [11], а также изоформа коллагена IV α3α4α5 [14], однако результаты применения данных маркеров представлены в единичных работах, что не позволяет сделать однозначные выводы об их чувствительности и специфичности.
В связи со сказанным выше актуальным остается вопрос более детального морфологического изучения иЭРМ, в частности исследования пространственной взаимосвязи иЭРМ с ВПМ, а также определения иммуногистохимических маркеров, позволяющих достоверно выявить ВПМ в составе изучаемых образцов, что и определило цель настоящего исследования.
Нами представлен оригинальный способ препарирования эпиретинальных мембран, отличительной особенностью которого является формирование ультратонких срезов исследуемого препарата, что позволяет послойно исследовать строение удаленных мембран.
Цель исследования – изучить пространственное расположение и взаимоотношение компонентов эпиретинальных мембран, удаленных в ходе хирургического вмешательства, а также определить иммуногистохимические маркеры, позволяющие достоверно выявить эпиретинальную и внутреннюю пограничную мембраны в исследуемых образцах.
В исследовании участвовали 29 пациентов (29 препаратов глаза) с диагнозом «идиопатический эпиретинальный фиброз». Критериями включения пациентов были жалобы на ухудшение зрения, искажения линий, букв, контуров предметов, острота зрения выше 0,3, возраст старше 40 лет. Критерии исключения – серьезные сопутствующие глазные или соматические заболевания, миопия более 6 диоптрий, астигматизм свыше 3,0 диоптрий.
Пациентам выполнено хирургическое вмешательство – трехпортовая 25–27 Gauge хромовитрэктомия с контрастированием иЭРМ и ВПМ витальными красителями. C помощью эндовитреального пинцета проводили удаление иЭРМ и ВПМ (рис. 1, 2). Удаленные образцы помещали в пробирки с 2,0 мл 4% параформальдегида с последующим иммуногистохимическим анализом их компонентов. Все этапы исследования одобрены локальным этическим комитетом МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова (протокол № 11 от 10.04.2024). Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на оперативное вмешательство.
Мембраны фиксировались по предложенной авторской методике (патент на изобретение № 2825847).
Препарат извлекали из раствора параформальдегида и размещали на пленке (Parafilm, Pechiney Plastic Packaging Company, США). С помощью шпателя и пинцета препарат мембраны сетчатки глаза ориентировали на поверхности пленки так, чтобы сохранялись исходная форма и топографические взаимоотношения частей препарата. Затем мембраны прикрепляли к пленке, фиксируя их края четырьмя шприцевыми иглами калибра 27 по шкале Гейдж (27G, 0,417 мм). Приготовленный таким образом препарат заливали криогелем Cryomatrix (6769006, Epredia™, Германия), после застывания иглы удаляли и выполняли нарезку срезов на криомикротоме (HM 525 NX UV, Thermo Fisher Scientific, Китай). Толщина среза составила 5 мкм, два среза помещали на одно предметное полилизиновое стекло (J2800AMNZ, Thermo Fisher Scientific, Германия).
Иммуногистохимическое исследование выполняли с целью выявления и визуализации следующих маркеров: коллаген IV α1α2 (ab6311, mouse, Abcam, Великобритания), ламинин γ3 (ab11575, rabbit, Abcam, Великобритания). Для этого подготовленные стекла с фрагментами мембран промывали стерильным раствором PBS (B-60201, «ПанЭко», Россия). Протокол иммуногистохимического исследования включал в себя следующие основные этапы: пермобилизация, раствор 0,1% Triton X100 (142314.1611, Panreac, Испания) в течение 10 минут, блокировка неспецифического связывания раствором 0,3% Tween 20 (A4974, Panreac, Испания) и 1% альбумина (68100, «ПанЭко», Россия) – 30 минут, инкубирование с первичными и вторичными антителами (Goat Anti-Mouse IgG (AF 594) (ab150080, Abcam, Великобритания) и Goat Anti-Rabbit (AF 488) (ab150077, Abcam, Великобритания) в течение 60 минут при комнатной температуре, ядра контрастировали красителем Hoechst #33258 (ab228551, Abcam, Великобритания), срезы монтировали под покровное стекло с использованием среды ImmunoHistoMount Medium (ab104137, Abcam, Великобритания). Анализ проводили на конфокальном лазерном сканирующем биологическом микроскопе FluoView FV10i (Olympus Corporation, Япония).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Excel (Microsoft Inc., США) и Jamovi (Jamovi project, Австралия). Для оценки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Данные с нормальным распределением представлены в формате M±σ, где М – среднее арифметическое, σ – среднеквадратическое отклонение. Данные с отсутствием нормального распределения приведены в формате Me [Q1; Q3], где Me – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили.
Клинико-демографические данные пациентов представлены в таблице.
Для выявления специфичности маркеров выполняли окрашивание удаленных образцов на антитела к ламинину γ3 и коллагену IV α1α2, которые предположительно должны окрашивать внутреннюю пограничную мембрану в составе образца. Известно, что иЭРМ содержит в клеточный слой, в то время как ВПМ, как и все базальные мембраны, лишена клеток. Таким образом, для выявления эпиретинальных мембран в образцах выполняли окрашивание ядерным красителем Hoechst #33258. В первом образце присутствует только внутренняя пограничная мембрана, эпиретинальная мембрана не выявлена (рис. 3). В составе второго образца визуализируется избирательное окрашивание ВПМ коллагеном IV α1α2, наличие иЭРМ подтверждается окрашиванием ядер клеток в составе мембраны (рис. 4)
В результате, исследуемые маркеры коллаген IV α1α2 и ламинин γ3 подтвердили свою специфичность при окрашивании ВПМ в составе изучаемых образцов.
Для подтверждения гипотезы о специфичности выбранных маркеров сформирована группа из 29 образцов иЭРМ + ВПМ, удаленных с поверхности сетчатки. При анализе данных иммуногистохимического исследования удаленных образцов были выявлены три тенденции формирования взаимоотношений между иЭРМ и ВПМ, которые нами названы морфологическими типами иЭРМ.
Раздельное расположение иЭРМ и ВПМ (восемь образцов).
иЭРМ с участками фиксации к ВПМ (11 образцов).
иЭРМ и ВПМ представляют собой единый комплекс с измененной структурой (10 образцов).
Для первого морфологического типа иЭРМ было характерно раздельное расположение иЭРМ и ВПМ без наличия участков фиксации (рис. 5)
При втором морфологическом типе иЭРМ отмечалось наличие как участков адгезии иЭРМ к ВПМ, так и участков свободного расположения мембран без фиксации. Визуализируется наличие участков адгезии иЭРМ с ВПМ (указаны красными стрелками на рис. 6), также помимо наличия участков адгезии в данном образце наблюдается обширная «складчатость» ВПМ, обусловленная предположительно выраженными контрактильными свойствами иЭРМ, которая показана на рисунке 7.
Ключевой особенностью третьего морфологического типа иЭРМ являлось наличие единой измененной структуры, окрашиваемой как на ламинин γ3, так и на коллаген IV α1α2 (рис. 8). При этом в данных мембранах невозможно различить отельные компоненты, образцы представляют собой конгломерат измененных клеток и внеклеточного матрикса.
Актуальным на сегодняшний день является исследование не только качественного клеточного состава иЭРМ, но и различных комбинаций взаимоотношения структурных компонентов эпиретинальной и внутренней пограничной мембран в их составе. Известно, что модификация клеточного фенотипа и функций клеток в процессе прогрессирования иЭРМ приводит к интенсификации синтеза компонентов ВКМ [3]. Чрезмерное накопление коллагена с изменением свойств ВКМ, в свою очередь, влияет на пролиферативный потенциал и способность к сокращению мембран, что клинически проявляется прогрессированием и выраженностью признаков заболевания. Тем не менее характер взаимодействия структур ВКМ между собой и с ВПМ сетчатки в иЭРМ изучен недостаточно.
Фиксация образцов иЭРМ с использованием ультратонких срезов позволила не только определить наличие искомых антигенов в составе изучаемого образца, но и визуализировать пространственное взаимоотношение компонентов ВКМ изучаемых мембран. Выявленные в рамках данной работы морфологические типы иЭРМ могут, с одной стороны, подтверждать результаты предыдущих работ [3], наглядно демонстрируя стадийность прогрессирования иЭРМ, а с другой – указывать на наличие отдельных различных форм заболевания, выявление которых при использовании клинических и инструментальных видов диагностики не представляется возможным. В пользу наличия отдельных форм патологии указывает тот факт, что длительность заболевания у исследуемых пациентов была статически однородна и составляла 6,9±1,2 месяца. Дальнейшее качественное и количественное изучение клеточного состава, соотношения компонентов ВКМ, изменений клеточной адгезии и пространственных взаимоотношений в составе иЭРМ, а также корреляция их с клиническими показателями пациентов с данным диагнозом позволит дать более детальную оценку выявленным морфологическим типам иЭРМ и определить стратегии по профилактике и лечению заболевания.
Ламинин γ3 и коллаген IV α1α2 являются достоверными маркерами внутренней пограничной мембраны, которые позволяют исследовать пространственные взаимоотношения идиопатической эпиретинальной мембраны и внутренней пограничной мембраны в составе изучаемых образцов идиопатической эпиретинальной мембраны при использовании предложенного метода фиксации с формированием ультратонких срезов. Предварительные результаты указывают на три тенденции формирования взаимоотношений между идиопатической эпиретинальной мембраной и внутренней пограничной мембраной (три морфологических типа идиопатической эпиретинальной мембраны), требующие дальнейшего изучения с использованием клинических данных и методов статистического анализа.