кандидат биологических наук; доцент кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
доктор медицинских наук; профессор кафедры ортопедической стоматологии и ортодонтии (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
доктор медицинских наук; заведующий кафедрой ортопедической стоматологии и ортодонтии (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Диффузная эндокринная система (ДЭС) тимуса регулирует пролиферацию и антигеннезависимую дифференциацию Т-лимфоцитов, контролирует миграцию и антигензависимую дифференциацию лимфоцитов в периферических иммунных органах, адаптацию к изменяющимся условиям внешней среды. У позвоночных животных выделяют три разные популяции клеток ДЭС тимуса: аргентафинные клетки, аргирофильные клетки и биоаминсодержащие клетки [1]. В тимусе птиц были выявлены три популяции клеток ДЭС, имеющих одинаковую локализацию и являющиеся тремя разными популяциями нейрональных/нейроэндокринных клеток: клетки, содержащие хромогранин А (CgA+), клетки, формирующиеся из нервного гребня (HNK-1+) и клетки, содержащие нейронспецифическую енолазу (NSE+) [2].
Клетки тимуса, формирующиеся из нервного гребня, могут быть выявлены с помощью антител к GFAP – глиальному фибриллярному кислому белку [3]. В тимусе GFAP+ являются афферентные и эфферентные нервные волокна, а также отростчатые клетки, которые образуют тесную «синапсоподобную» ассоциацию отростков немиелинизирующих шванновских клеток с различными подмножествами дендритных клеток и лимфоцитами – В-клетками, CD4+/CD8+ тимоцитами [4].
GFAP – это белок промежуточных филаментов (IF) типа III, который экспрессируется в астроцитах нервной системы [5, 6], глиальных клетках мезентеральной нервной системы [7–9], органах чувств [10, 11], селезенке [12], печени [13]. GFAP участвует в регуляции шаперонопосредованной аутофагии [14], оказывает положительное влияние на импорт D-аспартата через плазматическую мембрану и внутриклеточный транспорт белков [15].
Периодическая смена темного и светлого времени суток обеспечивает биохимические и физиологические ритмы подавляющего большинства организмов нашей планеты. Нарушение естественного ритма свет/темнота является стрессом для животных с дневной и ночной активностью, а длительное отсутствие фотопериодичности приводит к морфологическим изменениям в разных органах. Например, постоянный свет индуцирует оксидативный стресс и аутофагию клеток гиппокампа мышей [16], снижает число CD4+, CD8+, CD3+ клеток селезенки, подавляет дифференцировку и созревание молодых тимоцитов и обусловливает инволюцию тимуса [17]. Постоянное затемнение приводит к снижению числа дендритов и плотности шипиков нейронов в гиппокампе дневных животных, а постоянный свет к аналогичному снижению нейронной сложности в гиппокампе дневных и ночных животных [18].
Анализ научной литературы показывает, что в последние два десятилетия объем экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о метаболизме и иммуномодулирующих свойствах мелатонина, значительно увеличился. Это обусловлено большим числом терапевтических эффектов мелатонина: противовоспалительным [19], антиоксидантным, геропротекторным [20], онкопротекторным [21, 22]. Не подлежит сомнению, что в основе всех этих эффектов лежит иммуномодулирующая способность мелатонина. Тем не менее информации о том, как взаимосвязаны нервный, иммунный компоненты в лимфоидных органах в экспериментальной модели с изменением фотопериода, недостаточно.
Цель настоящего исследования состояла в изучении реакции GFAP+ клеток тимуса на отсутствие фотопериодичности и введение мелатонинсодержащего препарата мелаксен.
Объектом гистологического исследования служил тимус 60 половозрелых белых нелинейных мышей-самцов. Критерии включения: пол (самцы), возраст 3 недели (на сроке 3,5–4 недели тимус мышей развит максимально, с 4 недель начинается возрастная инволюция), масса 11–12 граммов, нормальная активность (подвижность оценивали с помощью теста «открытое поле»), густая блестящая шерсть, нормальный аппетит (мыши должны принимать пищу в 07:00 при кормлении). Критерии исключения: недостаточный или избыточный вес, редкая тусклая шерсть, недостаточная подвижность, агрессия, плохой аппетит (мыши не ели при кормлении в 07:00). При проведении исследования мы руководствовались положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных (18.03.1986). Модель исследования одобрена локальным этическим комитетом Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова (протокол № 5 от 10.11.2023).
Мелатонин вводили перорально (мелаксен, Unipharm, Inc., США)
Животные были распределены на шесть групп.
I – животные (n=10), которые содержались в течение 4 недель эксперимента в обычных условиях вивария (естественное освещение; продолжительность светового дня 8–9 часов (9/24); освещенность на уровне клеток в утренние часы 50–150 люкс, днем в пасмурный день до 300 люкс, в ясный день до 800 люкс, вечером 100–200 люкс; свободный доступ к питьевой воде и корму).
II – животные (n=10), получавшие синтетический мелатонин
III – животные (n=10), находившиеся в условиях постоянного затемнения (клетки размещались в темной комнате, освещенность в клетках в течение дня составляла 0,5–1 люкс (0/24), при кормлении 7–9 люкс) в течение 4 недель. Животные имели свободный доступ к питьевой воде и корму.
IV – животные (n=10), получавшие синтетический мелатонин
V – животные (n=10), находившиеся в условиях постоянного освещения (24/24, 700 люкс) в течение 4 недель (свободный доступ к питьевой воде и корму).
VI – животные (n=10), получавшие синтетический мелатонин
По окончании эксперимента мышам был 1 месяц и 3 недели. Их масса в среднем составляла 19,4±1,3 грамма. Животные были выведены из эксперимента методом ингаляции диоксида углерода. Тимусы извлекли сразу после усыпления на 28-е сутки эксперимента и фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными мышами, осуществлялись с учетом требований Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ Минздрава России от 19.06.2003 № 267).
Антитела к GFAP (клон SPM507, Spring Bioscience, США, в разведении 1:100) применяли для выявления астроцитоподобных клеток ДЭС в тимусе [24] и безмиелиновых нервных волокон [4].
Препараты обрабатывались одновременно по следующему алгоритму.
1) Депарафинизация в ксилоле и регидратация в спиртах нисходящей концентрации с последующим промыванием в дистиллированной воде 2–5 минут; 2) блокирование эндогенной пероксидазы в 3% водном растворе перекиси водорода 10 минут при комнатной температуре, промывание в дистиллированной воде 2–5 минут; 3) перенесение стекол в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH 7,4 на 5 минут (на этом этапе обработки и далее ФСБ может быть заменен трис-солевым буфером с pH 7,6); 4) инкубация с первичными антителами к GFAP во влажной камере при температуре +40°C 30 минут с последующим промыванием в ФСБ в течение 5 минут; 5) инкубация со вторичными антикроличьими или антимышиными антителами, соответственно, конъюгированными с полимером и пероксидазой хрена (EnVision+, Dako, Дания) 35 минут при комнатной температуре, далее промывание в ФСБ в течение 5 минут; 6) инкубация с раствором 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида (DAB+, Dako, Дания) под визуальным контролем, не допуская появления неспецифического фона, 2–3 минуты, затем промывание в 2–3 порциях дистиллированной воды по 3–5 минут в каждой; 7) подкрашивание препаратов гематоксилином Джилла в течение 30 секунд с последующим подсинением в щелочной воде; 8) дегидратация в спиртах восходящей концентрации, просветление в ксилоле и заключение в полистирол или другие перманентные среды.
Оптическая плотность – мера непрозрачности слоя вещества для световых лучей, то есть степень поглощения света изучаемым объектом. Чем больше света поглощает объект, тем выше его оптическая плотность.
D = lg (Fо/F),
где Fo – световой поток, падающий на образец;
F – световой поток, прошедший через образец.
Оптическая плотность является безразмерной величиной, измеряется от 0 (полное пропускание) до 2 (полное поглощение). Оптическая плотность прямо пропорциональна толщине поглощающего слоя, а также концентрации вещества в образце:
D = x × c × h,
где х – удельный показатель поглощения вещества;
с – концентрация вещества;
h – толщина поглощающего слоя.
При анализе клеток в препарате выбор объекта измерения осуществлялся по принципу случайного бесповторного отбора. Измеряли все клетки подряд, причем по возможности в разных участках среза, исключая поврежденные или явно атипичные [25].
Для оценки инволюции тимуса делали 10 замеров площади соответствующих участков по каждому животному и вычисляли среднее значение по каждой экспериментальной группе.
Описательную статистическую обработку проводили при помощи программы Statisticа 17 (IBM, США). Для анализа количества и оптической плотности исследуемых клеток использовали непараметрические статистические методы, так как выявлено ненормальное распределение, точки данных независимы. Сведения по количеству и оптической плотности исследуемых клеток представлены в виде Mе±SEM. Использовали U-критерий Манна–Уитни и критерий Краскела–Уоллиса. Информация по площади инволюции представлена в виде M±SE, так как выявлено нормальное распределение данных. Был рассчитан критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,01.
GFAP+ клетки в тимусе животных, содержавшихся при естественной смене световой и темновой фаз, встречались в наружной субкапсулярной зоне (СЗ), во внутренней корковой зоне, в кортикомедуллярной зоне (КМЗ) и мозговом веществе (МВ) дольки, но число исследуемых клеток преобладало в мозговом веществе и кортикомедуллярной зоне коркового вещества дольки (рис. 1 А, 2А). GFAP+ клетки МВ отростчатые, со слабой экспрессией GFAP (оптическая плотность 0,14±0,005) (рис. 1 В). В СЗ коркового вещества дольки исследуемые клетки были непостоянной округло-овальной формы, не имели отростков, средняя оптическая плотность GFAP равнялась 0,43±0,01 (рис. 1 С). В КМЗ локализовались клетки полигональной формы с выраженной экспрессией GFAP (оптическая плотность 0,69±0,02), без отростков (рис. 1 E).
В капсуле и септах тимуса, толще коркового вещества, адвентиции сосудов выявлялись GFAP+ нервные волокна (рис. 1 D, F).
В условиях постоянного затемнения (0/24) не выявлены достоверные изменения числа GFAP+ клеток ДЭС в МВ долек тимуса и КЗ (рис. 2 С), но в СЗ долек мы наблюдаем снижение числа исследуемых клеток в 2 раза (р=0,02). Оптическая плотность GFAP снижалась в клетках ДЭС КМЗ в 1,2 раза (р=0,0008), в клетках ДЭС СЗ в 1,6 раза (р=0,0004).
В отсутствии темнового периода, при постоянном освещении (24/24) увеличилось число исследуемых клеток в КМЗ долек в 1,5 раза (р=0,004), а в СЗ долек в 3 раза (р=0,006) (рис. 2 Е). Число GFAP+ клеток в мозговом веществе долек снижалось в 6,3 раза (р=0,0003) (рис. 3 А). В условиях постоянного освещения (24/24) оптическая плотность GFAP снижалась во всех исследуемых группах клеток: в клетках ДЭС МВ в 7 раз (р=0,005), в клетках ДЭС КМЗ в 2 раза (р=0,0009), в клетках ДЭС СЗ в 2 раза (р=0,005) (рис. 3 B).
В группе мышей, содержавшихся при постоянном затемнении (0/24), наблюдалась наименьшая средняя площадь инволюции тимуса – 384 638±458 мкм2. Показатели данной группы незначительно отличались от контрольных (469 761±1009 мкм2). Наибольшую же площадь инволюции тимуса (650 8372±1722 мкм2) имел тимус мышей, которые содержались при постоянном освещении (24/24).
Поступление мелатонина в условиях естественной смены световой и темновой фаз (9/15) приводило к уменьшению числа GFAP+ клеток ДЭС в мозговом веществе долек тимуса в 1,4 раза (р=0,006) и значительному увеличению названных выше клеток в КМЗ долек в 4,6 раза (р=0,01) (рис. 2 В). Оптическая плотность GFAP снижалась во всех исследуемых группах клеток: в клетках ДЭС МВ в 2,8 раза (р=0,0008), в клетках ДЭС КМЗ в 1,5 раза (р=0,001), в клетках ДЭС СЗ в 3,3 раза (р=0,0004) (рис. 3).
На фоне поступления мелатонина в условиях отсутствия световой фазы при постоянном затемнении (0/24) снижалось число GFAP+ клеток ДЭС в мозговом веществе долек в 1,2 раза (р=0,01) и в СЗ коркового вещества долек тимуса в 2 раза (р=0,02) (рис. 2 D). Оптическая плотность GFAP снижалась в клетках ДЭС МВ в 2,3 раза (р=0,002), в клетках ДЭС КМЗ в 2 раза (р=0,0001) (рис. 3).
Поступление мелатонина в условиях постоянного освещения восстанавливало экспрессию GFAP+ в стромальных клетках ДЭС мозгового вещества долек. Число GFAP+ клеток было снижено по сравнению с контрольными значениями (I группа), но наблюдалось повышение данного показателя по сравнению с V группой в 2,6 раза (р=0,05) (рис. 3 А). В дольках тимуса животных данной экспериментальной группы отмечено уменьшение числа клеток в КМЗ в 2 раза (р=0,001) (рис. 2 F).
Оптическая плотность GFAP повышалась во всех исследуемых морфофункциональных зонах: в клетках ДЭС МВ в 4 раза (р=0,0003), в клетках ДЭС КМЗ в 1,3 раза (р=0,04), в клетках ДЭС СЗ в 1,8 раза (р=0,001) (рис. 3 B). Одновременно происходило уменьшение средней площади инволюции тимуса в 1,9 раза (S инволюции = 3 379 106 мкм2).
В дольке тимуса GFAP+ клетки ДЭС встречаются в кортикомедуллярной, субкапсулярной зонах, толще коркового вещества и мозговом веществе долек. Изменение количества и морфологических параметров GFAP+ клеток демонстрирует перемену в активности клеток ДЭС, формирующихся из нервного гребня [3] и, вероятно, является отражением адаптивных либо деструктивных процессов. В условиях постоянного освещения (24/24) отмечается увеличение количества исследуемых клеток в КМЗ долек, а оптическая плотность GFAP снижается во всех исследуемых группах клеток. Глиальный фибриллярный кислый белок входит в состав цитоскелета и участвует в шаперонзависимой аутофагии [14], оказывает положительное влияние на импорт через плазматическую мембрану D-аспартата [15], который при увеличении содержания в клетке вызывает антипролиферативное действие, что было отмечено в лимфоцитах [26] и фибробластах [27]. Выявленное снижение содержания GFAP в условиях постоянного освещения может свидетельствовать о деструктивных изменениях в исследуемых клетках, что подтверждается усилением инволюционного процесса в тимусе. Таким образом, изменение содержания GFAP посредством регуляции внутриклеточной и межклеточной концентрации D-аспартата может влиять на пролиферацию Т-лимфоцитов.
Еще одной популяцией клеток периферического звена ДЭС являются биоаминпродуцирующие клетки, локализация которых совпадает с популяцией GFAP+ клеток. [28]. Известно, что в центральной нервной системе GFAP+ астроциты вырабатывают мелатонин и серотонин [29]. Если предположить, что и в тимусе популяции биоаминпродуцирующих и GFAP-позитивных клеток пересекаются, то снижение уровня GFAP может быть связано с повышением уровня серотонина в клетках ДЭС КМЗ и в микроокружении лимфоцитов и, как следствие, с усилением инволюции тимуса [28, 30].
Амфифильность мелатонина позволяет ему проникать через клеточные и ядерные мембраны и напрямую взаимодействовать с внутриклеточными структурами. Основные эффекты мелатонина связаны с действием на мембранные рецепторы лимфоцитов – MT1, MT2, МТ3 и ядерные рецепторы, принадлежащие к суперсемейству рецепторов ретиноевой кислоты RORα (NR1F1) и RORβ (NR1F2) [31]. В исследованиях L.P. Niles, K.J. Armstrong и других выявлено, что МТ1 рецепторы закладываются в прогениторных GFAP+ глиальных клетках нервной системы [32] и их стимуляция приводит к увеличению содержания GFAP в клетках и числа GFAP+ клеток [33].
Почему при поступлении мелатонина в условиях естественной смены темновой и световой фаз и при постоянном затемнении наблюдается уменьшение содержания GFAP, а при поступлении мелатонина в условиях постоянного освещения в течение 4 недель увеличение содержания GFAP в клетках ДЭС? Вероятно, при естественном фотопериоде и постоянном затемнении синтез пинеального мелатонина не нарушен и его воздействие кооперируется с экзогенным мелатонином. При постоянном же освещении синтез пинеального мелатонина подавлен. При этом важно учитывать и собственную продукцию мелатонина клетками ДЭС и лимфоцитами тимуса. Предполагаем, что превращение серотонина в мелатонин в клетках ДЭС и лимфоцитах тимуса в условиях освещения 24/24 также подавляется, так как в них происходит накопление серотонина [28]. Накопление серотонина в микроокружении лимфоцитов может являться основной причиной апоптоза последних, нарушая метаболизм триптофана и участвуя в развитии окислительного стресса [34], и именно в условиях иммуносупрессии проявляется стимулирующий эффект экзогенного мелатонина на пролиферацию лимфоцитов [35]. Зафиксировано снижение площади инволюции в тимусе по сравнению с группой животных, содержавшихся в аналогичных условиях и не получавших мелатонин. Выявленные в тимусе изменения под влиянием мелатонина сходны с изменениями в центральной нервной системе в условиях сдвига окислительно-восстановительного гомеостаза, когда наблюдаются снижение астроглиоза и нормализация содержания GFAP [36–38].
Наше исследование выявили чувствительность GFAP+ клеток диффузной эндокринной системы тимуса к отсутствию фотопериодичности. Мелатонин стабилизирует GFAP+ клетки тимуса, нормализуя в них содержание глиального фибриллярного кислого белка независимо от условий освещения, что дополняет знания о механизмах его геропротекторного действия.