кандидат биологических наук; ведущий научный сотрудник лаборатории морфологии (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России)
аспирантка 3 курса по специальности «клеточная биология» (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России)
кандидат ветеринарных наук; заведующая экспериментальной лабораторией (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России)
старший научный сотрудник экспериментальной лаборатории (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России)
кандидат ветеринарных наук; ведущий научный сотрудник экспериментальной лаборатории (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мировое признание метода чрескостного дистракционного остеосинтеза по Илизарову наступило в 1960-х годах, однако и в настоящее время данный метод остается одним из основных при восстановлении длины конечности, устранении посттравматической потери костной ткани и лечении ложных суставов [1–3].
Одним из существенных недостатков данного метода, обозначенных пациентами, является прорезывание кожного покрова и мягких тканей чрескостными фиксирующими спицами, что приводит к образованию рубцовых изменений кожи в области травмирования, нарушает внешний вид пролеченной конечности, вызывает психологический дискомфорт у пациентов, повышает риски проникновения инфекции [4–6].
Известно, что длительное проявление воспалительных процессов способствует замедлению эпителизации и формированию выраженных рубцовых изменений [7]. Научно обосновано, что раны, подверженные растяжению, имеют тенденцию к образованию грубых глубоких рубцов [8–10]. Несмотря на то, что точные молекулярные механизмы, определяющие реакцию кожи на физическое напряжение–растяжение, остаются пока неопределенными [11], роль волокнистого компонента в растянутой и нерастянутой коже коррелирует с осложнениями, связанными с заживлением ран [12].
Рубцовые изменения при заживлении ран кожного покрова связаны с нарушением синтеза фибробластами дермы ее коллагенового и эластинового компонентов [13]. Нарушение формирования сети эластических волокон способствует снижению эластичности и упругости зрелого рубца, а своевременное синтезирование эластина клетками, напротив, приводит к раннему сокращению ран и улучшению регенерации дермы [13, 14].
Внеклеточный матрикс в области заживления раны начинает формироваться на стадии пролиферации [15]. В этот период происходит накопление коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и протеогликанов, которые влияют на сократительные свойства кожного матрикса и участвуют в сближении краев раны [15–17].
Перестройка матрикса происходит на стадии ремоделирования после заживления кожной раны [15, 17]. В связи с этим изучение формирования внеклеточного матрикса, а именно эластического остова в разные периоды репарации поврежденной кожи необходимо для прогнозирования и своевременной коррекции результата лечения.
Несмотря на многолетнее изучение репаративных процессов в разных тканях в условиях чрескостного дистракционного остеосинтеза и существование проблемы, связанной с формированием кожных рубцов после лечения травматолого-ортопедической патологии с применением аппаратов наружной фиксации, исследования, посвященные выявлению особенностей заживления кожных ран, формирующихся в результате пролонгированного прорезывания кожи чрескостно проведенными спицами, не проводились.
Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей эластогенеза в кожном покрове при его повреждении (прорезывании) спицами дистракционного аппарата внешней фиксации
Экспериментальное исследование выполнено на 26 восьмимесячных крысах-самцах породы Вистар весом 390–420 граммам. Для расчета числа животных на эксперимент мы использовали ресурсное уравнение по Mead [18]. Животные содержались в стандартных условиях вивария при однотипном рационе питания. Эксперимент выполнен в соответствии с требованиями директивы Европейского парламента и Европейского совета № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [19]. Проведение настоящего исследования одобрено этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра травматологии и ортопедии имени академика Г.А. Илизарова (протокол № 4(68) от 11.11.2020).
Крысам основной группы (n=20) осуществляли чрескостный остеосинтез бедренной кости аппаратом наружной фиксации. Тракцию чрескожно проведенной проксимальной спицы создавали путем вращения гайки по стержневой части конструкции. Суточный темп подкруток составил 1 мм за четыре приема, имитируя прорезывание кожи при удлинении конечности. Дистракцию начинали через 5 суток после монтажа внешней конструкции, приближая условия к таковым в клинике, и, продолжали ее на протяжении 10 суток. Период фиксации аппаратом составлял 14 суток, затем аппарат демонтировали. Все операции выполняли в условиях операционной под общей анестезией животных (рометар 2% – 1-2 мг/кг, Bioveta, Чехия; золетил 100 – 10–15 мг/кг, Virbac Sante Animale, Франция). Крыс выводили из эксперимента передозировкой барбитуратов через 5 суток преддистракционного периода, через 5 (n=4) и 10 суток периода дистракции (n=4), 14 суток периода фиксации (n=4) и через 30 суток после демонтажа аппарата (n=4).
Исследовали кожную рану с прилегающими участками кожи. В качестве контрольной группы использовали интактных крыс аналогичного возраста (n=6), у которых изучали кожный покров наружной поверхности бедра.
Фиксацию забранных после выведения из эксперимента животных полнослойно иссеченных участков кожи из области интереса осуществляли в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этиловом спирте восходящей концентрации (от 70 до 100%) и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм готовили на санном микротоме НМ 450 (Thermo Scientific, США). Для выявления эластических волокон препараты окрашивали орсеином и литиевым кармином по Тенцеру–Унну. Окрашенные гистологические срезы сканировали с высоким разрешением в микроскопе для лабораторных исследований PANNORAMIC Midi II BF (3DHISTECH Ltd., Венгрия). На полученных цифровых изображениях в программе PANNORAMIC Viewer, версия 2.4 (3DHISTECH Ltd., Венгрия) при разном увеличении изучали особенности строения и локализации эластических волокон.
На изображениях гистологических препаратов при общем увеличении ×400 в программе «ВидеоТест Мастер-Морфология» (Санкт-Петербург, Россия) путем использования функции контрастного выделения измеряли общую площадь, занимаемую эластичными волокнами в площади поля зрения кожного регенерата и прилежащих к нему участках. Полученные данные переводили в процентную долю, занимаемую эластическими волокнами в общей площади поля зрения, которую принимали равной 100%.
Для определения характера распределения значений количественных признаков в анализируемых выборках использованы критерии Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка.
В некоторых группах нормальное распределение отсутствовало, в связи с чем использовали критерии непараметрической статистики. Полученные количественные данные представляли в виде медианы (Ме), первого (Q1) и третьего (Q3) квартилей. Для сравнения результатов каждого из этапов эксперимента между собой и с таковыми в контрольной группе (интактные животные) использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони [20]. Различия между сравниваемыми выборками считали статистически значимыми при p<0,01.
Гистологические исследования кожи бедра интактных крыс выявили, что в сосочковом слое дермы обнаруживалась нежная сеть тонких эластических волокон, ориентированных в нескольких плоскостях, ветви которых достигали границы базальной мембраны (рис. 1 А). Волокна имели преимущественно цилиндрическую форму и протяженность от 20 до 120 мкм, располагались между пучками коллагеновых волокон.
В сетчатом слое эластические волокна имели как цилиндрическую, так и лентовидную форму (рис. 1 В). Ширина лентовидных волокон была существенно больше цилиндрических. Волокна формировали сетчатые, веерообразные структуры и ветвистые образования, ориентированные в разных плоскостях между пучками коллагеновых волокон. Встречались единичные волнообразно изогнутые волокна. Эластические волокна обнаруживалась также вокруг волосяных фолликулов и в стенках сосудов кожи.
В экспериментальной (основной) группе животных восполнение диастаза начиналось через 5 суток дистракции. Между краями прорезанной спицей кожи в области глубоких и срединных слоев дермы формировалась рыхлая волокнистая соединительная ткань с участками грануляций (рис. 2 A).
Эпителизация раны отмечалась на небольшом протяжении со стороны ее краев. Эластический компонент обнаруживался в участках на границе с неповрежденной кожей, стенках сосудов и вокруг волосяных фолликулов и сальных желез (рис. 2 C). Волокна были представлены в виде коротких фрагментов цилиндрической формы (10–20 мкм), не имеющих определенной ориентации, либо имели кубовидный вид. В рыхлой соединительной ткани глубоких слоев кожного регенерата обнаруживались волнообразно извитые более протяженные эластические волокна, ориентированные в горизонтальной плоскости (рис. 2 E). Длина волокон составляла от 7 до 40 мкм.
Через 10 суток дистракции рана была полностью эпителизирована (рис. 2 B). Дермальный регенерат представлен преимущественно рыхлой волокнистой соединительной тканью. Локализация эластических волокон отмечалась в нем на границе с сетчатым слоем дермы неповрежденных краев кожи. Отмечено образование групповых скоплений клубочкообразной формы эластических волокон с локальными узелковыми утолщениями, визуализировали единичные короткие цилиндро- и кубообразные эластические волокна (рис. 2 D). В поверхностных слоях регенерата на границе с сосочковым слоем дермы неповрежденных краев кожи эластические волокна не обнаруживались. В глубоких участках регенерата извитых волокон становилось меньше, чем в предыдущий период. В этой зоне преобладали короткие волокна цилиндрической формы протяженностью от 10 мкм и не более 30–35 мкм (рис. 2 F).
Через 30 суток фиксации раневая поверхность была покрыта утолщенным эпидермисом. Дермальный слой регенерата, формирующегося в раневой полости, к данному периоду был представлен преимущественно фиброзной тканью с малым содержанием эластических волокон, расположенных по его периферии (рис. 3 A). Часто они были локализованы вокруг формирующихся волосяных фолликулов и сальных желез (рис. 3 C).
Волокна были сгруппированы в клубочки либо представляли собой короткие нитевидные структуры от 5 мкм до 23 мкм. В проекции сетчатого слоя встречались короткие волокна с волнообразной или спиралевидной извитостью, в области дна дефекта чаще кубовидной формы (рис. 3 E). В сосочковом слое эластические волокна не образовывались. В участках, расположенных рядом с раной, они визуализировались в обоих слоях дермы, но их сеть была существенно разрежена по сравнению таковой в сосочковым слое дермы кожи интактных животных.
Через 30 суток безаппаратного периода в поверхностном слое и в центральной части дермального регенерата эластические волокна не выявлялись (рис. 3 B). По периферии регенерата обнаруживались либо участки с гиперэластозом, либо единичные короткие, 5–7 мкм, эластические волокна, беспорядочно ориентированные между коллагеновыми (рис. 3 D). В глубоких слоях регенерата эластических волокон становилось меньше через 30 суток безаппаратного периода по сравнению с количеством волокон, обнаруженных на предыдущих периодах (рис. 2 F). Длина большинства волокон была менее 5–7 мкм.
Морфометрическое исследование показало, что через 5 суток эксперимента в преддистракционный период медиана объемной плотности эластических волокон в области раны была в 3,8 раза, а в прилежащих участках в 4,5 раза ниже по сравнению с таковой в дерме интактных животных (табл.). Через 5 и 10 суток дистракции содержание эластических волокон по отношению к интактной норме уменьшалось в 10,6 и в 14,9 раза, соответственно, и в 2,8 и в 1,4 раза – по отношению к предыдущему периоду эксперимента.
К окончанию периода фиксации содержание эластических волокон в тканях рубца незначительно увеличивалось по сравнению с окончанием периода дистракции (в 1,4 раза), оставаясь в 11 раз ниже, чем в коже интактных крыс.
Через 30 суток после демонтажа аппарата в области кожного рубца, сформировавшегося на месте раны, значения медианы объемной плотности эластических волокон в 1,7 раза превышали показатели предыдущего периода, но оставались в 6,4 раза ниже нормы.
Содержание эластических волокон в области рядом с кожным регенератом уменьшалось с 5-х суток дистракции в 1,3–1,8 раза, что в 5,7–7,9 раза было достоверно меньше, чем в норме. При этом значения на этапах эксперимента достоверно не изменялись по отношению друг к другу и оставались такими и в безаппаратный период.
Изучение патогенеза заживления ран и разработка новых инструментов и протоколов для мониторинга процесса заживления, безусловно, могут способствовать оптимизации лечения и получению лучших результатов у пациентов [21].
Формирование полноценного заживления кожной раны с хорошим косметическим эффектом связано с процессами коллагено- и эластогенеза [12, 13, 22]. В коже дермальные фибробласты продуцируют белковые мономеры, в частности эластин и фибриллин, которые в конечном счете формируют зрелое эластичное волокно [13]. Нарушение эластогенеза при повреждениях кожи у взрослых приводит к изменению ее механических свойств [23, 24].
В нашем исследовании обнаружено существенное снижение содержания эластических волокон в рубцовой ткани, формирующейся в области повреждения кожного покрова спицевыми наружными фиксаторами как в ранние периоды эксперимента, когда происходит синтез внеклеточного матрикса, так и в более поздние, соответствующие органотипической перестройке волокнистого компонента кожного регенерата. Даже через месяц безаппаратного периода (60 суток эксперимента) содержание эластического компонента в кожном регенерате остается очень низким (в 6,3 раза меньше, чем в норме).
Результаты проведенных нами исследований во многом схожи с наблюдениями других специалистов, отмечающих, что в рубцовой ткани кожного покрова зрелые эластические волокна могут определяться только через многие месяцы после получения кожной травмы [14, 23, 25]. Фрагментированные (короткие) волокна, спиралеобразные и агрегированные в клубочкообразные структуры с наличием узелковых образований в виде локальных утолщений, локализованные по периферии кожного регенерата, которые мы наблюдали на этапах эксперимента, описаны также в публикациях, посвященных изучению формирования келоидного рубца [26, 27].
Снижение эластогенеза и формирование рубцовой ткани в области заживления, формирующейся на этапах эксперимента раны, мы связываем с пролонгированной травматизацией кожи при ее натяжении.
Прорезывание кожи спицей в условиях чрескостного остеосинтеза осуществляется в течение всего периода дистракции, пролонгируя тем самым фазы гемостаза и воспаления в заживлении раны. Для такого типа ран характерно большое количество клеток Лангерганса, нейтрофилов, провоспалительных макрофагов и протеаз [24, 28]. Нейтрофилы выделяют сериновые протеазы, такие как эластаза, и металлопротеиназы (МПП), способствующие деградации самих эластических волокон и разложению растворимого и нерастворимого эластина [28–30].
Нейтрофильная коллагеназа (ММП-8) и эластаза разрушают важные факторы роста, такие как PDGF и TGF-β, в то время как коллагеназа разрушает и инактивирует компоненты внеклеточного матрикса. Производство факторов роста при растяжении увеличивается [31], однако снижается их биодоступность. Задержка высвобождения факторов роста кератиноцитов (KGF)-1 и (KGF)-2, IGF-1 и EGF приводит к замедленной эпителизации раны [32].
Провоспалительные цитокины, такие как IL-1β и TNF-α, вырабатываемые нейтрофилами и активированными макрофагами, не только увеличивают выработку ММП, но и снижают тканевые ингибиторы ММП (TIMP); этот дисбаланс усиливает деградацию внеклеточного матрикса, ухудшает миграцию клеток, снижает пролиферацию фибробластов и синтез ими фибриллина, эластина, фибронектина и коллагена [33, 34].
Воспалительные макрофаги способствуют дифференцировке фибробластов в миофибробласты и секреции ими профибротической изоформы TGF-β1 [35], что создает условия для формирования фиброзной ткани в области заживающей раны [36].
Таким образом, в результате длительного прорезывания кожи спицей аппарата наружной фиксации пролонгируются период полной эпителизации раны и фаза воспалительного процесса [22], что отрицательно влияет на эластогенез и ведет к формированию глубокого рубца.
Проведенные нами исследования показали, что тракционное прорезывание спицей приводит к задержке эпителизации кожной раны, нарушая естественную продолжительность фаз репаративного процесса, и формированию рубцовой ткани с очень малым содержанием деструктурированных эластических волокон. Эти данные должны послужить сигналом для разработки методов коррекции заживления такого типа ран, улучшающих косметический результат лечения патологий костной ткани у пациентов с применением спицевых или спицестержневых аппаратов наружной фиксации.