Введение

Веррукозную карциному (ВК) слизистой оболочки полости рта (СОПР) относят к высокодифференцированному варианту плоскоклеточного рака (ПР) СОПР. По данным P. Sihavongetal [1], ВК составляет 2–16% случаев ПР СОПР. В отличие от плоскоклеточной карциономы ВК медленно растет, редко дает отдаленные метастазы и имеет более благоприятный прогноз после лечения.

Веррукозная гиперплазия (ВГ) СОПР относится к предраковым поражениям и может трансформироваться как в ВК, так и в инвазивный ПР [2]. Веррукозная гиперплазия и веррукозная карцинома имеют общие клинико-морфологические характеристики на фоне дисплазии эпителия. Эти два заболевания могут проявляться в виде безболезненного обширного налета или массы белого цвета с шероховатой поверхностью. В связи с этим только на основании клинических проявлений их отличить невозможно [3].

При гистологическом исследовании образцов с ВК и ВГ обнаруживают гиперпластические изменения эпителия без нарушения целостности базальной мембраны, а также определяются гипер- или паракератоз. При ВК также могут отмечаться акантоз и хронический воспалительный процесс в собственной пластинке слизистой оболочки, поэтому для установления точного диагноза необходимо проводить дополнительные исследования. В рутинной практике для их дифференциальной диагностики применяют иммуногистохимический метод (ИГХ).

Для распознавания злокачественных опухолей при помощи метода ИГХ золотым стандартом является выявление активно пролиферирующих клеток. Для этого используют антитела к белку Ki67, который обнаруживается во время фаз клеточного цикла G1, S, G2 и M и при этом не визуализируется во время фазы G0 [4]. При изучении пролиферативной активности клеток при помощи антител к Ki67 определяется индекс пролиферативной активности, который может быть использован как для диагностики заболевания, так и для оценки его прогноза. Ki-67 применяют при изучении развития опухолевых и неопухолевых состояний матки, желудка, предстательной и молочной желез [5]. В более ранних исследованиях, описанных в отечественных и зарубежных источниках, отмечена повышенная пролиферация клеток при развитии злокачественного процесса [6].

Ген TP53 – это супрессор опухолевых клеток, который кодирует белок p53. p53 обнаруживается в ядрах клеток и проявляется как дикий тип (WTp53) при повышенной пролиферации клеток и как мутантный тип (MTp53) при наличии мутаций в TP53. Активация данного белка происходит при высокой пролиферации клеток и нарушениях генома. Основной функцией WTp53 является остановка роста клеток либо активация апоптоза в делящихся клетках. Благодаря этому ограничиваются рост и деление потенциально малигнизированных клеток.

Мутации в гене TP53 являются наиболее распространенными среди генетических изменений при онкологических заболеваниях и приводят к образованию и накоплению MTp53. По данным D. Sund et al. [7], его накопление обнаруживается более чем в 85% случаев рака. MTp53 способствует пролиферации, инвазии и метастазированию раковых клеток. При накоплении MTp53 не только происходит инициация онкогенеза, но и затрудняется проведение противоопухолевой терапии, что существенно влияет на прогноз развития заболевания [8]. В настоящее время известно о небольшом числе исследований с использованием различных клонов белка p53, проведенных одновременно при ВГ и ВК.

Цель работы – оценить ИГХ реакцию на Ki67 и p53 при ВГ и ВК.

Материалы и методы

Исследование проведено на архивном операционном и биопсийном материале лаборатории патологической анатомии Национального медицинского исследовательского центра «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» за период с 2021 по 2024 год. Были отобраны образцы, полученные в отделении заболеваний слизистой оболочки рта от пациентов с предварительным клиническим диагнозом «веррукозная лейкоплакия». Исследование одобрено этическим комитетом Российского университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы (протокол № 1 от 14.01.2025). Изучены парафиновые срезы СОПР 27 пациентов (16 женщин и 11 мужчин), средний возраст которых составил 65,4 года. При гистологическом исследовании были установлены два диагноза, на основании которых сформированы две группы: «веррукозная гиперплазия» – 18 случаев (66,6%) и «веррукозная карцинома» – девять случаев (33,3%).

Гистологическое и ИГХ исследование материала проводили согласно стандартному протоколу. Пролиферативную активность клеток изучали с использованием мышиных моноклональных антител к Ki67 (MM1, Diagnostic BioSystems, США), p53+ клетки определяли при помощи мышиных моноклональных антител к p53 Clone DO-7 (Novocastra, Великобритания). Данный маркер выявляет одновременно мутантный и дикий тип белка. Для определения экспрессии только мутантного белка применяли моноклональные кроличьи антитела к p53 CloneY5 (Epitomics, США). ИГХ исследование проводили по протоколу Quanto. Использовали реагенты UltraVision Quanto Detection System (Thermo Fisher Scientific, США), включая полимерный конъюгат пероксидазы хрена (HRP). Исследование проводилось на установке Autostainer 360 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания). Визуализацию и фотофиксацию вели с помощью микроскопа Axioplan 2 Imaging (Karl Zeiss, Германия) и камеры AxioCam ERc5s (Karl Zeiss, Германия).

Определили отношение количества иммуноположительных ядер клеток к общему числу ядер клеток, были изучены индекс пролиферации (Ki67) и оценено количество p53+ клеток в ростковом и шиповатом слоях эпителия по ИГХ реакции с использованием Clone DO-7 и CloneY5.

Статистическую обработку данных проводили в среде Windows 10 (IBM Corporation, США), используя SPSS Statistics 23 version (США). При помощи критерия Манна–Уитни между исследуемыми группами были выявлены статистически значимые различия при p<0,001.

Результаты

Гистологическое исследование

При изучении ВГ отмечались утолщение всего слоя эпителия, а также пара- и гиперкератоз. В 11 случаях из 18 (61,1%) в собственной пластинке слизистой оболочки находили признаки хронического воспаления. Клетки базального слоя образовывали широкие эпителиальные выросты в собственную пластинку СОПР, целостность базальной мембраны сохранялась на всем протяжении. Атипичные клетки и патологические митозы не обнаружены. При гистологическом изучении ВК обнаруживали утолщенный эпителий, целостность базальной мембраны также не нарушалась. Во всех случаях наблюдались гиперкератоз и воспалительный инфильтрат в собственной пластинке слизистой оболочки, который состоял преимущественно из лимфоцитов. В верхних слоях эпителия клетки были хорошо дифференцированы, в нижней трети эпителиального слоя отмечались нарушение рядности клеток и патологические митозы, что послужило отличительным признаком от ВГ (рис. 1 A, В).

Иммуногистохимическое исследование

Пролиферативная активность клеток определялась во всех группах. При ВГ Ki-67+ клетки наблюдались в ростковом слое и единично в шиповатом. При ВК положительная реакция к данному белку была выше и хорошо проявлялась не только в ростковом слое СОПР, но и в шиповатом (рис. 2 А, B).

При исследовании белка p53 с клоном D-07 иммунореактивные клетки отмечались во всех группах и располагались в базальном слое, но не визуализировались в шиповатом. Окрашивание ядер клеток оценивалось как умеренное. В группе ВК отмечалось более интенсивное окрашивание, чем в группе ВГ, как в ростковом, так и в шиповатом слое эпителия (рис. 2 C, D).

В группе ВГ окрашивание ядер на белок p53 клоном Y5 определялось в единичных клетках базального слоя в 83,3% случаев (15 из 18), при ВК иммуноположительная реакция была более выражена в базальном слое во всех случаях, а в 88% случаев окрашенные клетки затрагивали 2/3 толщины шиповатого слоя эпителия (рис. 2 E, F).

Количественные результаты исследований представлены в таблице. В исследовании реакции на белок p53 дикого типа WTp53 в ВГ показатель положительных клеток составил 19,40% (16,40; 21,10), в ВК 26% (25,70; 27,10), при этом в группе ВК интенсивность окрашивания ядер была выше. При изучении белка MTp53 в группе ВГ показатели составляли 5,10% (2,90; 5,60)%, в группе ВК – 28,10% (27,10; 29,90). Наличие единичных иммуноположительных клеток в группе ВГ можно охарактеризовать как проявление начальных изменений генома и развитие неоплазии.

Обсуждение

Ki67 является маркером выбора для определения количества активно делящихся клеток, так как его ядерная локализация обнаруживается во всех фазах клеточного цикла, кроме G0 [9]. В неизмененном эпителии пролиферативная активность клеток СОПР наблюдается в базальном и парабазальном слое [10]. В исследовании при ВК значение индекса пролиферативной активности клеток приближается к значению при ПР [11].

Отсутствие окрашенных на белок MTp53 клеток в группе ВГ в некоторых случаях можно объяснить тем, что он часто стабилизирован и проявляется только в измененных клетках, тогда как WTp53 (клон DO-7) регулируется и поддерживается на низком уровне в гомеостатических условиях и имеет быстрый период полураспада [7].

Наличие MTp53+ клеток в группе ВГ даже в единичном количестве может свидетельствовать о проявлении начальных признаков мутаций в геноме клеток. Ранее было описано, что мутантный белок p53 способствует приобретению опухолевых свойств клетками, которые противодействуют защитной функции дикого типа данного белка [12]. A. Petitjean et al. изучили взаимосвязь мутаций в гене ТР53 и развития опухолевого процесса [13]. Авторы Jiahao Hu et al. также отмечают, что при появлении мутаций в этом гене происходит накопление белка MTp53 более чем в 75% клеток, а также нарушается работа белка WTp53 [13, 14].

Ген-супрессор опухоли TP53 кодирует белок p53, участвующий во многих ключевых процессах в клетке, например, в регуляции клеточного цикла, метаболизме глюкозы, репарации ДНК, апоптозе и старении. Его активация может быть индуцирована разными сигналами стресса, такими как воспаление, нарушение метаболизма, влияние радиации и токсичных веществ, а также гипоксия и выработка активных форм кислорода [15]. Мутации в данном гене приводят к нарушению регуляции клеточного цикла, что может проявляться повышением пролиферации клеток. По данным K. Voskarides et al. [16], повреждения в гене TP53 обнаруживаются примерно в 50% опухолей, а появление p53+ клеток является распространенным ранним явлением при малигнизации эпителия.

Выявление MTp53+ ядер клеток свидетельствует о наличии миссенс- и нонсенс-мутаций гена TP53 [17]. В случае инактивации этого гена из-за мутаций утрачивается функция регуляции белка дикого типа, которая в физиологических условиях воздействует на клетки после разных сигналов стресса и активирует сигнальный путь p53, что может запустить несколько программ транскрипции, включая остановку клеточного цикла, репарацию ДНК, старение и апоптоз. Все эти события могут привести к подавлению роста опухоли. Инактивация гена TP53 способствует инвазии, пролиферации и выживанию поврежденных клеток, тем самым содействует прогрессированию рака и метастазированию [18].

J.K. Peltonen et al. [15] провели исследование по изучению накопления МТp53 при развитии неоплазии, где описали значение и частоту мутаций ТР53 при раке головы и шеи. Помимо нарушения клеточного цикла в виде апоптоза поврежденных клеток белок МTp53, накапливаясь в клетках, повреждает ДНК через пострансляционные модификации.

Ранее K. Sawada et al. [19] было проведено изучение поломки гена TP53 при дисплазии эпителия СОПР. Авторы использовали ИГХ метод для оценки p53+ клеток. Они также определяли количество делеций в локусе 17p13.1 методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Данный метод был использован для изучения активности теломеразы и количественного выявления мутаций в хромосомном участке 3q26.2 в гене TERC (Telomerase RNA Component) с целью определения злокачественности веррукозной лейкоплакии [20].

По изучению распределения белка p53 существует целый ряд исследований при различных заболеваниях СОПР, таких как эритроплакия, дисплазия разной степени выраженности и плоскоклеточный рак, что подтверждает его диагностическое значение [21].

Заключение

Антитела к белку MTp53 (клон Y5) можно использовать при дифференциальной диагностике веррукозной гиперплазии и веррукозной карциномы. Иммуноположительная реакция в клетках указывает на наличие мутаций в геноме эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта.