кандидат биологических наук; старший научный сотрудник лаборатории гликобиологии (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
доктор медицинских наук; врач-патологоанатом (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России)
кандидат медицинских наук; заведующий научно-исследовательским отделом ангионеврологии и нейрохирургии (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России)
кандидат медицинских наук; врач-патологоанатом (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России)
младший научный сотрудник лаборатории гликобиологии (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины)
доктор медицинских наук; заведующий патологоанатомическим отделением (ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России); профессор кафедры патологической анатомии (ФГБОУ ВО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор биологических наук, профессор; ведущий научный сотрудник лаборатории гликобиологии (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины); заведующая лабораторией клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции центральной научно-исследовательской лаборатории (ФГБОУ ВО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор биологических наук; заведующая лабораторией гликобиологии (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины); доцент кафедры клинической биохимии факультета медицины и психологии В. Зельмана (ФГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет)
кандидат биологических наук; старший научный сотрудник лаборатории гликобиологии (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины); старший преподаватель кафедры молекулярной биологии и биотехнологии факультета естественных наук (ФГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Глиома высокой степени злокачественности Grade 4 (ГЛ Gr.4) – одно из наиболее агрессивных заболеваний головного мозга, которое характеризуется плохим прогнозом и медианой выживаемости 15 месяцев [1]. Несмотря на успехи, достигнутые в понимании биологии опухолевого процесса, лечение этого заболевания до сих пор остается нерешенной задачей. Одним из факторов, определяющих низкую эффективность лечения ГЛ Gr.4, может быть вариабельность индивидуальных опухолей и клеточного состава каждой конкретной опухоли [2].
В настоящее время известно, что для злокачественных глиом характерна морфологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность. Молекулярно-генетическое тестирование с определением мутации в генах
Природу внутриопухолевой [6] и межопухолевой [7] гетерогенности первичных опухолей ЦНС активно изучают. Предполагается, что внутриопухолевая гетерогенность обусловлена генетически, эпигенетически и функционально разными клеточными субпопуляциями в пределах одной опухоли, что может способствовать формированию резистентности новообразования к проводимой радио- и химиотерапии [8, 9]. Многим новообразованиям, в том числе злокачественным глиомам, также свойственна иммунная гетерогенность, при которой выделяются субтипы в зависимости от содержания иммунных маркеров [10]. Наконец, свой вклад в гетерогенность первичных опухолей ЦНС помимо собственно опухолевых клеток способно вносить и их микроокружение [11]. Таким образом, злокачественные глиомы гетерогенны по многим параметрам.
Рост глиальных опухолей часто сопровождается развитием отека головного мозга. Для устранения данного состояния используют в том числе глюкокортикостероидные препараты, оказывающие свои эффекты через взаимодействие с глюкокортикоидным рецептором (ГР). Экспрессия последнего у пациентов с ГЛ Gr.4 вызывает особый интерес. Широко экспрессируясь в головном мозге, ГР вовлечен не только в функции ЦНС, но и во многие другие процессы, такие как адаптация к стрессу, модуляция иммунной системы [12]. Регуляция экспрессии генов при активации ГР зависит от физиологического и/или патологического состояния органа [13], включая онкологические заболевания, при которых взаимодействие ГР с глюкокортикостероидными препаратами может вызывать даже противоположные эффекты [14]. Вместе с тем анализу гетерогенности содержания ГР в глиомах к настоящему времени посвящены лишь отдельные работы, причем выполненные на ограниченной выборке пациентов [15]. Пока остается без внимания и тот факт, что в природе гетерогенности опухолей ЦНС немаловажную роль может играть исходная неоднородность содержания ГР в ткани мозга.
Цель исследования – изучить гетерогенность содержания ГР в ГЛ Gr.4 в экспериментальных опухолях
В рамках ретроспективного исследования случай–контроль были использованы диагностические биоптаты пациентов с гистологическим диагнозом ГЛ Gr.4 (согласно классификации ICD-O [3]). В исследование вошел 51 пациент (24 мужчины и 27 женщин, средний возраст которых составил 55 лет – от 18 до 80 лет). Группу сравнения формировал материал головного мозга, полученный у 23 пациентов (11 мужчин и 12 женщин, средний возраст которых составил 40 лет – от 11 до 68 лет), оперированных по поводу сосудистых мальформаций. Патоморфологическое исследование биопсийного материала пациентов проводилось с помощью гистологических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов диагностики. У 18% пациентов с глиомами методом полимеразной цепной реакции была выявлена мутация в гене
Материал фиксировали в 10% забуференном формалине с последующим изготовлением парафиновых блоков по стандартной методике. Работа одобрена комитетом по биомедицинской этике Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики (протокол № 5/2017 от 23.07.2017).
Для изучения гетерогенности содержания ГР в экспериментальных опухолях
Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). Мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации согласно руководству по гуманному обращению с животными (National Research Council Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory, 2011). Работа одобрена комитетом по биомедицинской этике Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики (протокол № 6/2017 от 23.07.2017).
После иссечения левое полушарие головного мозга мышей фиксировали в 10% забуференном формалине и заключали в парафин (BioVitrum, Россия). Коронарные срезы получали приблизительно на одном расстоянии (5±0,5 мм) от
У пациентов и животных с опухолью анализировали как собственно опухолевую ткань, так и околоопухолевую область. Околоопухолевой областью считали зоны без диффузного опухолевого роста и распространенного клеточного полиморфизма, когда в поле зрения количество атипичных клеток не превышало 1–2% при ×400. У пациентов с сосудистыми мальформациями анализировали нервную ткань мозга в межсосудистой зоне. В нервной ткани головного мозга мышей, не измененной опухолевым процессом, анализу подвергали поля зрения, включающие молекулярный, наружный зернистый с зоной перехода в пирамидный слои коры, в пределах первичной (M1) и вторичной (M2) моторной коры и первичной соматосенсорной коры (SIHL, SIFL, S1BF и иногда S1DZ), начиная от центральной борозды по окружности полушария.
Для оценки содержания ГР на срезах проводили непрямую иммунопероксидазную реакцию с моноклональными антителами против ГР-антигена (ab. 183127, Abcam, США) в разведении 1:1000. Для визуализации продуктов реакции применяли систему детекции (ab64264, Abcam, США). Демаскировку антигенов проводили с помощью буфера с pH 9 (Dewax and HIER Buffer Н, Thermo Scientific, США). Срезы изучали при помощи микроскопа AxioScopeA1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении до 400 раз.
Для подсчета клеток, имеющих ядерную локализацию ГР (объектив ×40), на каждом препарате анализировали не менее 5 неперекрывающихся полей зрения площадью 5000 мкм2. Степень выраженности иммуногистохимической реакции оценивали по визyaльнo-аналоговой шкале, используемой в клинической практике при исследовании ядерных маркеров опухолей головного мозга (American Society of Clinical Oncology (ASCO) / College of American Pathologists, CAP). Согласно данной системе, в каждом образце рассчитывали процент ядер клеток с различной интенсивностью окраски (от 1 до 3 баллов): +++ (3 балла) – высокое содержание, ++ (2 балла) – умеренное содержание, + (1 балл) – слабое содержание, – (0 баллов) – белок отсутствует. На основании данных по распространенности и интенсивности сигнала для каждого образца также был определен интегральный показатель содержания ГР. Для его расчета процент ядер, имеющих различную интенсивность окраски (показатель распространенности сигнала), умножали на 3 балла, 2 балла и 1 балл, соответственно (то есть на показатель интенсивности сигнала), затем цифры, полученные для каждого образца, суммировали.
Интегральный показатель (ИП) = [(% на 0) × 0] + [(% на 1+) × 1] + [(% на 2+) ×2] + [(% на 3+) × 3] [17].
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы OriginPro 8.5 (OriginLab, США). Проверку соответствия выборок закону нормального распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Статистическую значимость различий определяли с использованием теста Манна–Уитни. При попарном сравнении различия считали значимыми при р<0,05, при сравнении трех групп вносилась поправка Бонферрони.
У 57% пациентов с ГЛ Gr.4 в опухоли выявлялось высокое содержание ГР (значение ИП содержания ГР составляет 200–300), у 29% умеренное (значение ИП содержания ГР составляет 100–200), а у 14% слабое содержание ГР или белок отсутствовал (значение ИП содержания ГР составляет 0–100) (рис. 1 A, 2). При попарном сравнении содержания ГР между всеми подгруппами регистрировались статистически значимые отличия: низкий–умеренный ИП p=0,00024, умеренный–высокий ИП p=0,000000076, низкий–высокий ИП p=0,000053 (рис. 1 B). Характерно, что во всех трех подгруппах присутствовали пациенты как с мутацией в гене
В околоопухолевой области у пациентов с ГЛ Gr.4 подгруппы с высоким, низким и средним содержанием рецептора были представлены практически в равных долях (рис. 1 A), и между ними также имелись попарные различия (низкий–умеренный ИП p=0,00577, умеренный–высокий ИП p=0,00336, низкий–высокий ИП p=0,00797) (рис. 1 B). Высокое содержание рецептора в околоопухолевой области по сравнению с опухолью встречалось реже, процент таких пациентов составлял 33%. Напротив, низкое содержание рецептора в околоопухолевой области по сравнению с опухолью встречалось чаще (28%). В группе сравнения превалировали пациенты с умеренным содержанием ГР (48%), при этом доля пациентов с низким содержанием ГР становилась выше, чем у пациентов с ГЛ Gr.4 с сохранением значимых различий в показателях ИП между подгруппами (низкий–умеренный ИП p=0,00019, умеренный–высокий ИП p=0,012, низкий–высокий ИП p=0,016) (рис. 1 B).
Результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антител к ГР, демонстрирующие высокий, умеренный и низкий уровень ИП содержания маркера в клинических образцах, представлены на рисунке 2.
Таким образом, у пациентов с ГЛ Gr.4 в опухолевой ткани преобладало высокое содержание ГР, в околоопухолевой области все три уровня содержания (высокий, умеренный и низкий) регистрировались приблизительно с равной частотой, тогда как в ткани головного мозга, не измененной опухолевым процессом, выявлялось преимущественно умеренное содержание ГР.
В экспериментальной модели было показано, что у всех мышей линии SCID в привитой опухоли выделялась только одна из трех подгрупп, которые регистрировались у пациентов (рис. 3 A, 4). В околоопухолевой области у животных высокое содержание ГР выявлялось значительно реже, и такая подгруппа составляла лишь 55%, при этом появлялась подгруппа с умеренным содержанием маркера (45%). По ИП экспрессии ГР эти подгруппы статистически значимо отличались (p=0,008). У интактных мышей было показано наличие только двух подгрупп, отличающихся уровнем содержания ГР. Доля мышей, относящихся к каждой из подгрупп, не имела существенных различий при сравнении с таковой в ткани околоопухолевой области: 60% составляли животные с высоким содержанием ГР, 40% с умеренным. По ИП содержания ГР эти подгруппы животных также имели статистически значимые отличия (p=0,0017) (рис. 3 B).
Результаты иммуногистохимического окрашивания с использованием антител к ГР, соответствующие умеренному и высокому ИП содержания ГР, у экспериментальных животных представлены на рисунке 4.
У мышей линии SCID c ортотопическими глиомами U87 в опухолевой ткани выявлялось исключительно высокое содержание ГР у всех животных, тогда как в околоопухолевой области и нормальной ткани подгруппы с умеренным и высоким уровнем содержания ГР присутствовали практически в равных долях.
В нашем исследовании установлено, что у пациентов с ГЛ Gr.4 уровень содержания ГР является индивидуальным и можно выделить подгруппы с различным базовым содержанием белка.
Попытки иммуногистохимической оценки экспрессии ГР в глиомах предпринимались и ранее, но были немногочисленными и выполненными на ограниченной выборке пациентов (n=8) [17]. Однако даже в сравнительно малочисленной группе пациентов авторы отмечали межопухолевую гетерогенность и преимущественно высокий уровень содержания ГР (ИП=3). Эти данные совпадают с результатами данной работы, позволившей на репрезентативной выборке не только подтвердить разницу в содержании ГР у пациентов с ГЛ Gr.4, но и выявить подгруппы, статистически значимо отличающиеся друг от друга по ИП (с высоким, умеренным и низким уровнем ГР). Преобладание в проанализированных клинических образцах высокого содержания ГР с ИП выше 200 также согласуется с выводами предыдущего исследования [17].
В отличие от клинического материала пациентов в опухолях экспериментальных животных регистрировался лишь высокий уровень содержания маркера. Это может объясняться тем, что в эксперименте для получения опухолей животным вводили только одну клеточную линию глиомы U87, а глиомы пациентов являются морфологически гетерогенными и мультиформными. Характерно, что у мышей низкое содержание ГР не выявлялось ни в околоопухолевой, ни в нормальной ткани головного мозга, что отличает их от пациентов, и что может быть видовой особенностью данных животных. Таким образом, пациентам с ГЛ Gr.4 свойственна более высокая гетерогенность содержания ГР по сравнению с экспериментальными животными, что предположительно может быть обусловлено влиянием более гетерогенного микроокружения.
Работы, посвященные изучению характера экспрессии ГР в головном мозге, не измененном опухолевым процессом, также немногочисленны. Методом иммуногистохимии продемонстрировано, что общая интенсивность иммунореактивности ГР в головном мозге была самой высокой в перинатальном периоде, снижалась до низкой интенсивности примерно к 12-му дню постнатального периода, а затем снова постепенно увеличивалась до умеренного окрашивания в большинстве областей мозга [18]. Также удалось установить, что и в нормальной нервной ткани имеет место внутривидовая гетерогенность содержания ГР, в том числе зависящая от возраста и стадии онтогенеза [19]. Результаты, полученные в нашей работе, свидетельствуют о наличии гетерогенного содержания ГР и у линейных мышей одного возраста, что дополняет данные литературы.
Для того чтобы изучить особенности экспрессии ГР в связи с развитием глиальной опухоли, у пациентов с ГЛ Gr.4 и у экспериментальных животных распределение рецептора было также изучено в околоопухолевой ткани и ткани, не измененной опухолевым процессом. Проведенное исследование показало, что в клинике в условном ряду опухоль–околоопухолевая ткань–клинический контроль снижаются доли пациентов, характеризующихся высоким уровнем содержания ГР в головном мозге. У животных при анализе экспериментальных опухолей, околоопухолевой и нормальной ткани головного мозга наблюдалась похожая динамика: снижение содержания ГР в головном мозге по мере уменьшения в исследованных образцах количества опухолевых клеток. Таким образом, можно предположить, что трансформация нервной ткани, сопряженная с опухолевым процессом, сопровождается повышением содержания ГР.
Совокупность полученных данных создает предпосылки для поиска путей использования особенностей содержания ГР в ГЛ Gr.4 в клинических целях. Так, у пациентов с высоким ИП содержания ГР в опухоли можно ожидать лучший ответ на терапию дексаметазоном, чем у пациентов с низким уровнем содержания рецептора. Нельзя оставлять без внимания и тот факт, что глюкокортикоиды воздействуют не только на опухоль, но и на ткань головного мозга, не измененную опухолевым процессом. Ранее было показано, что даже однократное введение дексаметазона в дозировке 2,5 мг/кг мышам вызывало очаговые изменения тинкториальных свойств ядер и цитоплазмы нейронов, а также перицеллюлярный и периваскулярный отек, а при многократном введении препарата эффект на морфологию префронтальной коры оказался более выраженным [20]. Можно предположить, что у пациентов с низким уровнем содержания ГР противоотечное действие глюкокортикодных препаратов может быть снижено при одновременной инициации нарушений в окружающей опухоль ткани. Поскольку в настоящее время четкие клинические рекомендации по назначению дексаметазона и корректировке его дозы отсутствуют, иммуногистохимическая оценка содержания ГР в операционных биоптатах пациентов с ГЛ Gr.4 может стать одним из потенциальных инструментов, позволяющих клиницистам предположить эффективность ответа на терапию глюкокортикоидами в послеоперационном периоде.
У пациентов с глиомами высокой степени злокачественности Grade 4 зарегистрировано гетерогенное содержание глюкокортикоидного рецептора, характеризующееся наличием трех подгрупп, разных по уровню содержания глюкокортикоидного рецептора с преобладанием высокого. В ортотопических экспериментальных глиомах U87 мышей линии SCID выявляется только высокое содержание глюкокортикоидного рецептора. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что высокое содержание глюкокортикоидного рецептора может быть обусловлено самим фактом злокачественного роста опухоли в головном мозге, при котором клетки претерпевают генетические, эпигенетические, транскрипционные и фенотипические изменения.