кандидат медицинских наук; старший научный сотрудник лаборатории нейроморфологии (ФГБНУ Научный центр неврологии)
кандидат биологических наук; заведующая лабораторией экспериментальной патологии нервной системы и фармакологии (ФГБНУ Научный центр неврологии)
лаборант-исследователь лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и фармакологии (ФГБНУ Научный центр неврологии)
кандидат медицинских наук, доцент; научный сотрудник лаборатории нейроморфологии (ФГБНУ Научный центр неврологии); доцент кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии (ФГАОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России)
лаборант-исследователь лаборатории нейроморфологии (ФГБНУ Научный центр неврологии); ассистент кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии (ФГАОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России)
лаборант-исследователь лаборатории нейроморфологии (ФГБНУ Научный центр неврологии)
доктор медицинских наук, профессор; заведующий лабораторией нейроморфологии (ФГБНУ Научный центр неврологии); профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии (ФГАОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Изучению роли митохондриальной динамики, в частности деления митохондрий в норме и при патологии нервной системы, посвящено много исследований [1, 2]. Такие фундаментальные процессы как пролиферация и дифференцировка нейронов, их выживание, рост аксонов и дендритов, формирование синаптических контактов и медиаторный обмен тесно связаны с ремоделированием митохондрий [3]. Изменения морфологии митохондрий по мере развития нейрона в настоящее время достаточно хорошо изучены и коррелируют с адаптационной метаболической перестройкой дифференцирующихся клеток [3, 4]. Установлено, что пролиферирующие нейрональные стволовые клетки имеют удлиненные митохондрии, в предшественниках нейронов органеллы фрагментируются, а по мере дифференцировки клеток отмечается нарастание митохондриальной массы, вновь сопровождающееся увеличением длины органелл. Модификация митохондриальной динамики приводит к изменениям нейрогенеза: так, подавление слияния митохондрий угнетает пролиферацию и обновление популяции нейрональных предшественников, а снижение уровня деления митохондрий нарушает их дифференцировку [3–5]. Деление митохондрий традиционно считается событием, индуцирующим апоптоз в различных типах клеток, включая нейроны, но в последние годы рассматривается и как компенсаторный механизм, поддерживающий нейрональные функции и регулирующий синаптическую пластичность [6].
Ключевым белком, опосредующим митохондриальное деление, является цитозольная ГТФаза Drp1 (dynamin related protein), взаимодействующая с адаптерными белками Mff, Fis1, MiD49 и MiD50 на наружной мембране митохондрий. Адаптерные белки при этом определяют судьбу будущих новообразованных органелл, а разнообразие рецепторов обеспечивает тонкую регуляцию функционирования Drp1 [7]. Активность Drp1 задает размер, форму и распределение митохондрий по всему нейрону, от сомы до нервных окончаний. Наибольшее содержание Drp1 обнаруживается в соме и дендритах нейронов, в меньшей степени – в аксонах и аксональных терминалях [8], что коррелирует с особенностями внутриклеточной компартментализации митохондрий [9].
За последние два десятилетия предложено несколько ингибиторов Drp1, обладающих разной селективностью [1] и рассматриваемых как потенциальные терапевтические агенты, так как их нейропротекторные эффекты были продемонстрированы на моделях различных неврологических заболеваний. Помимо этого фармакологические ингибиторы митохондриального деления широко используют в модельных системах для изучения роли митохондриальной динамики в разных клеточных процессах.
Впервые mdivi-1 был описан как ингибитор деления митохондрий, селективно тормозящий активацию Drp1. mdivi-1 препятствует конформационным изменениям Drp1, необходимым для самосборки и гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ), что предотвращает митохондриальное деление [10, 11]. Однако в последнее время появилось достаточно свидетельств о неспецифичности действия mdivi-1 в отношении Drp1 и обсуждаются нецелевые эффекты этого соединения [12, 13].
Наряду с этим многочисленные исследования свидетельствуют о нейропротективном эффекте mdivi-1 при моделировании многих неврологических заболеваний: ишемического инфаркта мозга, болезни Альцгеймера, Паркинсона и Гентингтона, а также – при черепно-мозговой травме [1, 2, 11, 14, 15]. На животных моделях и
Поскольку работ, непосредственно рассматривающих влияние mdivi-1 на структуры мозга в норме, недостаточно, а изучение возможностей регуляции молекулярных механизмов динамики митохондрий представляет интерес с точки зрения репаративного и адаптационного потенциала нервной ткани, целью исследования было охарактеризовать морфологическими методами влияние mdivi-1 на нейроны гранулярного слоя зубчатой извилины (ЗИ) гиппокампа и процесс нейрогенеза в субгранулярной зоне.
В работе использованы 20 самцов крыс линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая», возраст животных на момент начала экспериментов составил 4 месяца. Манипуляции с животными проводили в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), приказом Минздрава России № 119н от 01.04.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», а также руководствуясь Правилами работы с лабораторными грызунами и кроликами (ГОСТ 33216-2014). Исследование одобрено этическим комитетом Научного центра неврологии (протокол № 5-3/22 от 01.06.2022). Животные содержались в стандартных условиях вивария с неограниченным доступом к пище и воде при 12-часовом световом режиме. Эксперимент начинали после их 10-дневной адаптации к условиям вивария.
Животным (n=10) внутрибрюшинно вводили раствор BrdU («ПанЭко», Россия) в дозе 40 мг/кг, ежедневно, три последовательных дня, каждые 24 часа. Срок между введением BrdU и введением mdivi-1 был выбран, исходя из времени созревания нейронов в субгранулярной зоне, с целью оценить влияние mdivi-1 на созревание нейронов в ЗИ гиппокампа (рис. 1). Через 2 недели после введения BrdU крысам выполняли стереотаксические операции. Животные получали золетил-ксилазиновый наркоз (золетил-100, 0,3 мг/кг (Virbac, Франция), ксила, 3 мг/кг, внутримышечно (Interchemie Werken De Adelaar, Нидерланды). При помощи стереотаксического аппарата RWD билатерально (координаты по: Paxinos and Watson. The rat brain in stereotaxic coordinates) вводили mdivi-1 (по 2,33 мкг в 0,1% DMSO, в 0,9% растворе NaCl в каждое полушарие) в желудочки мозга пяти животным, а контрольная группа (ложнооперированные, группа sham – SH, n=5) получала инъекции носителя в том же объеме.
mdivi-1 (IM2550, Solarbio) растворяли в безводном диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma), после чего разбавляли 0,9% раствором NaCl. Конечная эмульсия содержала 2% DMSO и 10 мг/мл mdivi-1, его вводили первой группе животных (n=5) внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг два последовательных дня. Доза была выбрана, исходя из ранее опубликованных данных [15]. Контрольной группе животных (группа control – Ctrl, n=5) внутрибрюшинно вводили только носитель в том же объеме.
Поведение животных оценивали до проведения манипуляций и через 14 дней после внутрижелудочкового или внутрибрюшинного введения веществ. Установка «Открытое поле» («Открытая наука», Россия) для оценки двигательной активности представляла собой короб 97×97×40 см из жесткого ПВХ, продолжительность теста – 3 минуты. Регистрацию поведения крыс и последующий анализ данных проводили с помощью системы видеонаблюдения Any-Maze (Stoelting Inc., США) с программным обеспечением.
Для оценки уровня тревожности использовали Т-образный лабиринт («Открытая наука», Россия), приподнятый над полом на 76 см, два закрытых рукава которого имели боковые и торцевые стенки высотой 30 см, а у открытого рукава стенок не было. Ширина рукавов составляла 14 см, длина 50 см, на их пересечении располагался стартовый отсек – площадка размером 10×10 см. В начале эксперимента крысу помещали на начало открытого рукава. Продолжительность теста составляла 3 минуты.
Животных выводили из эксперимента на 14-й день после введения mdivi-1 и проведения поведенческих тестов. Крыс декапитировали гильотиной, мозг извлекали и фиксировали 24 часа в 10% формалине. Исследование выполняли на фронтальных срезах, полученных при помощи криостата, 15 мкм толщиной. Использовали антитела против белков митохондриальных комплексов: субъединицы 30 кДа комплекса I (NDUFS3,ab183733, Abcam, США), субъединицы B сукцинатдегидрогеназы (SDHB, ab175225, Abcam, США), АТФ-синтазы (ATP5H, clone 7F9BG1, Invitrogen, США); синаптических белков: синаптофизина (SYP, ab32127, Abcam, США) и белка постсинаптического уплотнения PSD95 (clone 7E3-1B8, Invitrogen, США); антитела к маркерам нейрональной дифференцировки – даблкортину (DCX, 4604S, Cell Signalling, США), полисиалированной нейрональной молекуле клеточной агдезии (PSA-NCAM, clone 12E3, Invitrogen, США), а также к бромдезоксиуридину (BrdU, Bu20a, Cell Signalling, США) и маркерному белку зрелых нейронов NeuN (ab177487, Abcam, США) для оценки созревания нейрональных предшественников. Перед нанесением антител срезы подвергали температурной демаскировке в пароварке (0,01 М цитратный буфер, 0,05% Tween-60, pH 6,0, +96–98°, 15 минут). Для выявления BrdU срезы выдерживали в 1M HCl 20 минут при температуре +37°. Cрезы промывали фосфатным солевым буфером, содержащим 0,05% Triton X-100. Для разведения антител использовали буферный раствор IHC Diluent (Leica Biosystems, США) в соотношении, рекомендованном производителем антител. Для блокирования неспецифического связывания применяли раствор БСА (Protein block, ab64226, Abcam, США). Связывание антител визуализировали при помощи соответствующих вторичных антител осла или козы (Invitrogen, США), меченных флуорохромами Alexa 488 и Alexa 594 (Thermo Fisher Scientific, США).
Для количественной оценки и документирования использовали микроскоп Nikon Eclipse Ni-u (Nikon, Япония) с камерой Nikon Ds-Qi (Nikon, Япония), программное обеспечение NIS Elements Br и ImageJ-FIJI. При увеличении объектива ×40 измеряли интенсивность флуоресценции (среднюю яркость пикселей в единицах 8-битной шкалы) SDHB, NDUFS3, PSD95, ATP5H в телах нейронов гранулярного слоя гиппокампа (области ядер исключали из измерения), интенсивность флуоресценции при выявлении SYP оценивали во внутреннем молекулярном слое ЗИ. Размеры митохондриальной фракции оценивали по локализации SDHB, как описано ранее [19]. В эксперименте с введением BrdU число BrdU+ и NeuN+ клеток на поле зрения подсчитывали вручную, при увеличении объектива ×20, верифицируя локализацию BrdU в ядрах нейронов при ×40. Число DCX+ клеток оценивали на изображениях, сделанных на всем протяжении ЗИ гиппокампа, и выражали в единицах на 1 мм длины, измеряемой по нижней ее границе. Распределение DCX+ клеток оценивали при помощи функции distance map. На основе оценки кратчайшего расстояния между DCX+ клетками вычисляли индекс агрегации Кларка–Эванса, безразмерный показатель распределения точек на плоскости, возрастающий при кластеризации объектов [20]. Подсчет типов DCX+ нейронов выполняли на препаратах с двойным окрашиванием на DCX/PSA-NCAM для надежной оценки морфологии дендритов по классификации Plumpe [21]. Для количественного анализа использовали не менее 5–12 серийных срезов гиппокампа от животного, взятых из ростральной его трети с интервалом от 120 мкм. Полученные результаты усредняли.
По технической причине (количество срезов) в экспериментах с выявлением PSD95, SDHB, NDUFS3, PSA-NCAM группы контроля для внутрижелудочкового введения составила четыре животных, а для выявления ATP5H все группы были уменьшены на одно животное.
Статистическую обработку выполняли в программе GraphPad Prism (GraphPad Software, США). Данные представляли в виде медианы и межквартильного размаха или среднего и среднеквадратичного отклонения (SD). Для сравнения нескольких групп использовали непараметрический критерий Краскела–Уоллиса (K-W ANOVA) c апостериорным тестом Данна. В ряде случаев дополнительно проводили двухфакторный анализ ANOVA c факторами «воздействие» (растворитель или mdivi-1) × «способ введения» (группы icv или i/p). Для оценки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Прочие примененные тесты указаны в тексте и подписях к рисункам. Статистически значимыми считали отличия при p<0,05.
Как внутрижелудочковое (группа icv), так и внутрибрюшинное введение mdivi-1 (группа i/p) приводило к значимому снижению количества DCX+ нейрональных предшественников в ЗИ гиппокампа животных (рис. 2), что указывает на уменьшение нейрогенеза. В группе с внутрижелудочковым введением также выявляли статистически значимое (K-W ANOVA, p=0,03) повышение индекса Кларка–Эванса (возрастающего при кластеризации объектов), что свидетельствует о формировании групп DCX+ клеток у животных под действием mdivi-1.
Анализ соотношения морфологических типов DCX+ нейронов показал, что в группе icv была значимо снижена доля PSA-NCAM+, DCX-содержащих клеток в постмитотической фазе, имеющих длинные и разветвленные дендриты, доходящие до молекулярного слоя (тип E-F, согласно работе [21]). К типу С-D относили нейроны с неразвитыми дендритами, не доходящими до молекулярного слоя, а тип A-B составляли клетки на митотической стадии с короткими отростками или лишенные их (рис. 2). Двухфакторный дисперсионный анализ показал значимое (ANOVA F (2, 21) = 8,735, p=0,002) взаимодействие факторов «тип нейронов» × «воздействие».
Исходя из этих данных, введение mdivi-1 замедляет дифференцировку нейронов, что подтверждает оценка количества меченных BrdU ядер NeuN+ нейронов (рис. 2). В группе icv под влиянием mdivi-1 число NeuN+/BrdU+ нейронов значимо снижалось (t-тест, p=0,02).
Полученные результаты указывают на то, что mdivi-1 подавляет нейрогенез, снижает развитие дендритов у DCX+ нейронов и, по-видимому, влияет на миграцию нейрональных предшественников в субгранулярной зоне гиппокампа, что может отражать выявленная по повышению индекса Кларка–Эванса кластеризация DCX+ клеток.
Интенсивность окрашивания на синаптофизин (локализованный преимущественно пресинаптически) оценивали во внутреннем молекулярном и полиморфном слое ЗИ (рис. 3). Известно, что внутренняя часть молекулярного слоя представлена преимущественно дендритами гранулярных нейронов и комиссуральными и ассоциативными входами, в то время как аксоны гранулярных клеток формируют синапсы в полиморфном слое. Статистически значимых изменений окрашивания на синаптофизин в полиморфном слое не обнаружили (K-W ANOVA, p=0,13), тогда как в молекулярном слое выявили существенное снижение интенсивности окрашивания в группе icv (K-W ANOVA, апостериорный тест Данна, p=0,02) и сходную тенденцию для группы с внутрижелудочковым введением (i/p). Двухфакторный анализ ANOVA показал статистически значимое влияние mdivi-1 на содержание синаптофизина в молекулярном слое (фактор «воздействие» ANOVA F (1, 16) = 13,41, p=0,0021) и отсутствие влияния способа его введения (p=0,61).
Обратные изменения наблюдали в уровне окрашивания на белок постсинаптической плотности PSD95 в гранулярном слое (рис. 3). В группе icv выявляли тенденцию к увеличению, а в группе i/p обнаруживали статистически значимое увеличение интенсивности окрашивания на PSD95 (K-W ANOVA, апостериорный тест Данна, p<0,01). Двухфакторный анализ ANOVA выявил статистически значимое влияние mdivi-1 (фактор «воздействие» ANOVA F (1, 15) = 13,62, p=0,002) и отсутствие влияния способа его введения (p=0,37).
Окрашивание на пре- и постсинаптические белки определило их разнонаправленные изменения под действием mdivi-1 в области синаптических контактов с клетками гранулярного слоя. Изменения синаптических связей могут влиять на активность гранулярных нейронов и на нейрогенез в субгранулярной зоне.
В эксперименте с внутрижелудочковым введением mdivi-1 (группа iсv) обнаружили статистически значимое увеличение (K-W ANOVA, p=0,013) среднего размера митохондрий (рис. 4) в гранулярном слое – митохондриальной фракции, выявляемой по локализации SDHB, однако в группе i/p таких изменений не выявили. Двухфакторный анализ ANOVA подтвердил влияние взаимодействия факторов («ВОЗДЕЙСТВИЕ» × «СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ», F (1, 15) = 6,5, p=0,022) на этот показатель, что говорит о разной выраженности ингибирования митохондриального деления и влияния mdivi-1 на митохондриальную морфологию при разных способах введения.
Оценка интенсивности окрашивания на белки дыхательных комплексов I (NDUFS3) и II (SDHB) не выявила значимого влияния mdivi-1 на их содержание в нейронах гранулярного слоя. При этом в дополнительно проведенном тесте было обнаружено значимое (тест Манна–Уитни, p=0,02) снижение интенсивности окрашивания на субъединицу комплекса V (ATP5H) при внутрибрюшинном введении mdivi-1 (окрашивание в группе icv не проводили).
Таким образом, полученные данные демонстрируют влияние mdivi-1 на морфологию митохондрий, но отсутствие изменений экспрессии исследованных белков митохондриальных комплексов, за исключением АТФазы.
В тесте «Т-образный лабиринт» при внутрижелудочковом введении mdivi-1 наблюдалась тенденция (p=0,06, тест Вилкоксона) к увеличению соотношения времени нахождения животных в открытом и закрытом рукавах (рис. 4, p=0,06, тест Вилкоксона). При этом число заходов в закрытые рукава значимо не менялось. Интраперитонеальное введение mdivi-1 не привело к изменению времени нахождения в открытом рукаве, однако было отмечено статистически значимое снижение числа заходов в закрытые рукава (p=0,049, ANOVA, апостериорный тест Тьюки, данные не показаны).
В тесте «Открытое поле» введение mdivi-1 не оказало влияния на общую локомоторную активность животных как при интравентрикулярном введении (ANOVA, p=0,91, средняя дистанция составила 10,2±3,1 м у ложнооперированных животных и 12,5±2,4 м в группе, получавшей mdivi-1), так и при интраперитонеальном (ANOVA, p=0,75, в группе контроля 10,5±3,9 м, в группе, получавшей mdivi-1, 9,6±3,6 м). При этом в группе icv наблюдали статистически значимое увеличение времени, проводимого животными в центральной зоне арены (рис. 5, p<0,01, тест Вилкоксона, по сравнению с теми же крысами до введения mdivi-1).
Таким образом, при интрацеребровентрикулярном введении mdivi-1 наблюдалась тенденция к увеличению времени нахождения в открытом рукаве в Т-образном лабиринте и в центральной зоне в тесте «Открытое поле», что свидетельствует о снижении тревожности животных.
Согласно полученным результатам, mdivi-1 влияет на поведение животных при внутрижелудочковом введении и многосторонне воздействует на нейроны гранулярного слоя гиппокампа при обоих способах введения – внутрижелудочковом и внутрибрюшинном. Введение mdivi-1 подавляло нейрогенез и дифференцировку нейронов в ЗИ, при этом оказывало разнонаправленное действие на синаптические белки SYP и PSD95. Мы не обнаружили изменений экспрессии или локализации белков митохондриальных комплексов I и II (NDUFS3 и SDHB), но выявили влияние mdivi-1 на размеры митохондрий лишь в группе, получавшей внутрижелудочковые инъекции. В связи с тем, что сведения о метаболизме и фармакокинетике mdivi-1 в литературе не представлены, неясно, являются ли выявленные в нашей работе отсроченные изменения размеров митохондрий результатом непосредственного блокирования связывания mdivi-1 и Drp1 или это вторичные явления. В дополнение к этому обнаруженное снижение интенсивности окрашивания на субъединицу АТФ-синтазы ATP5H указывает на воздействие mdivi-1 на дыхательную цепь митохондрий.
Работы последних лет демонстрируют роль митохондрий в нейрогенезе [4]. Дифференцировка нейральных стволовых клеток, их созревание и миграция сопровождаются активацией деления митохондрий и переключением метаболизма с гликолиза на окислительное фосфорилирование, что обусловлено возрастающими потребностями клеток в АТФ [4]. При этом изменения активности комплексов дыхательной цепи митохондрий связаны с балансом митохондриальной динамики, что предполагает ключевую роль слияния и деления митохондрий в определении судьбы клеток.
Обнаруженное нами снижение уровня нейрогенеза в субгранулярной зоне гиппокампа под действием mdivi-1, очевидно, связано с его влиянием на митохондриальные процессы. Вместе с тем действие mdivi-1 на эти органеллы неоднозначно. Основной акцент в изучении активности mdivi-1 как потенциально высокоспецифичного ингибитора ГТФазы Drp1 был сделан на подавление патологической фрагментации митохондрий [11, 15]. В более поздних работах описаны непосредственное связывание и ингибирующий эффект mdivi-1 в отношении митохондриального комплекса I, приводящий к снижению продукции АТФ [12, 13].
Так, в работе N. Marx et al. [13] показано, что mdivi-1 нарушает сборку комплекса I митохондрий и респираторных суперкомплексов, необходимых для эффективного транспорта электронов. Мы не выявили изменений иммуноокрашивания комплекса I, но обнаружили снижение интенсивности окрашивания на АТФ-синтазу, что может объясняться описанным N. Marx et al. нарушениями работы электрон-транспортной цепи, нарушением продукции АТФ и гомеостаза Ca2+ под действием mdivi-1. Отметим, что показанное в нашей работе отсутствие изменений в интенсивности флуоресценции при выявлении NDUFS3 не исключает образование дефектных форм комплекса I, как это было продемонстрировано в [13].
Обе предполагаемые мишени mdivi-1 – как комплекс I митохондрий, так и Drp1 – тесно связаны с дифференцировкой нейрональных предшественников. Известно, что изменения митохондриальной динамики в дифференцирующихся нейронах сопровождаются увеличением экспрессии Drp1 [19, 22], а его нокаут подавляет нейрогенез и нарушает дифференцировку нейронов [23]. Было показано, что индукция слияния митохондрий с помощью mdivi-1 вскоре после деления нейральных стволовых клеток блокирует их дальнейшую дифференцировку [5]. Другим важным аспектом влияния Drp1 как мишени для mdivi-1 может быть его участие в регуляции биогенеза пероксисом [24].
Для нейрональных предшественников в субвентрикулярной зоне ранее описано снижение миграции под действием mdivi-1, что согласуется с нашими результатами для субгранулярной зоны гиппокампа. Так, в работе Kim et al. [22] описано, что миграция нейрональных предшественников сопровождается энергозависимым ремоделированием цитоскелета, с чем связана локализация митохондрий у переднего полюса дифференцирующихся нейронов, а ингибирование Drp1 приводит к перинуклеарной конденсации митохондрий и нарушает миграцию клеток-предшественников. Слияние митохондрий и увеличение их размеров могут препятствовать изменению их распределения в клетке и нарушать миграцию нейрональных предшественников [22]. Эти результаты согласуются с нашими данными об образовании кластеров DCX+ клеток в субгранулярной зоне гиппокампа после введения mdivi-1.
Поскольку Drp1-зависимая фрагментация митохондрий связана с поздними стадиями апоптоза, возникает вопрос о влиянии mdivi-1 на нейрогенез через антиапоптотические механизмы. Участие Drp1 в индукции апоптоза дифференцирующихся клеток неоднозначно, например в плюрипотентных стволовых клетках оверэкспрессия Drp1 предотвращала апоптоз, усиливая митофагию, и наоборот, при их дифференцировке уменьшение активности Drp1 снижало митофагию и усиливало апоптоз [25]. Работ, посвященных влиянию mdivi-1 на апоптоз в гранулярной извилине гиппокампа в норме, мы не обнаружили, хотя есть данные о снижении под действием mdivi-1 апоптоза нейрональных предшественников на генетической модели болезни Дауна [26] и уменьшении активации каспазы-3 наряду со снижением высвобождения цитохрома-С в культуре нейральных стволовых клеток при окислительном стрессе [27]. Кроме того, в литературе обсуждается роль апоптотических белков для обеспечения специфических нейрональных процессов, например участие каспаз в росте и прунинге аксонов и синаптической пластичности [28]. mdivi-1, ингибируя Drp1, вероятно, может действовать на эти процессы, влияя и на регуляцию апоптотических каскадов.
При нейрогенезе в зрелом мозге важную роль играет отбор нейронов путем апоптоза при их включении в уже существующие нейронные сети. По-видимому, в связи с этим на этапе дифференцировки и раннего синаптогенеза отмечается потеря 30–70% незрелых нейронов в нейрогенных зонах в зрелом мозге грызунов [29]. По данным оценки нейрогенеза, в зрелом мозге крыс [30] количество BrdU+ клеток в зубчатой извилине наиболее выраженно снижается начиная со 2-й недели после введения BrdU, достигая 62% от начального количества к 4-й неделе, после чего не меняется. Снижение числа NeuN- (незрелых) клеток происходит между 1-й и 4-й неделями, причем наибольшее снижение отмечается до 2-й недели, а к четырем неделям NeuN- клеток не остается. Прирост числа NeuN+ нейронов происходит в аналогичном объеме и временнóм интервале, что указывает на то, что многие NeuN клетки в этот период дифференцируются в нейроны [30].
Таким образом, усиление деления митохондрий в нейрональных предшественниках, связанное с переключением клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование, а также на более поздних этапах с ростом дендритов [31], по-видимому, предшествует этапу наиболее выраженной апоптотической гибели вновь образованных нейронов. Можно предположить, что вероятное снижение под действием mdivi-1 уровня апоптоза и его нейропротективное действие нивелировались в нашем эксперименте нарушениями на более ранних этапах нейрогенеза, ассоциированных с ремоделированием митохондрий, а также влиянием mdivi-1 на митохондриальные комплексы, что приводило к выявленному снижению плотности DCX+ нейрональных предшественников и количества NeuN+/BrdU+ клеток в гранулярном слое. Оценка влияния mdivi-1 на апоптоз в нейрогенных нишах и регуляцию численности вновь образованных нейронов требует дальнейших исследований.
Чтобы оценить влияние mdivi-1 на созревание нейронов гранулярного слоя, мы провели анализ выраженности ветвления дендритов DCX+ клеток в молекулярном слое. В нейронах гранулярного слоя ЗИ гиппокампа наиболее многочисленными и сложно организованными являются митохондрии дендритных шипиков, что, вероятно, обусловлено их участием в обеспечении синаптической передачи. Показано, что в ходе постнатального нейрогенеза в ЗИ дендритные митохондрии изначально фрагментированы [32], что может быть необходимо для их распределения вдоль растущих дендритов. По мере интеграции вновь образованных нейронов в существующие нейрональные сети происходит усложнение формы митохондрий. В нашем исследовании морфологическая оценка DCX+ предшественников показала снижение количества DCX+ клеток с длинными, разветвленными дендритами поддействием под влиянием mdivi-1, что указывает на нарушения формирования фенотипа зрелых гранулярных нейронов.
Выявленные нами на морфологическом уровне изменения локализации и экспрессии синаптических белков дополняются данными литературы о влиянии mdivi-1 на синаптические процессы. Так, на экспериментальных моделях нейродегенеративных заболеваний выявляли повышение синаптической активности под действием mdivi-1, что связывают с восстановлением митохондриальных функций [17, 18]. Например, mdivi-1 снижал фрагментацию митохондрий и восстанавливал экзоцитоз синаптических везикул, сниженный под действием бета-амилоида [33]. Этим данным противоречит упомянутая ранее публикация N. Marx et al. [13], в которой в нормальных условиях выявили снижение нейротрансмиссии под действием mdivi-1.
Мы предполагаем, что влияние Drp1 на синаптичеcкую передачу не ограничивается вкладом в аксональную биоэнергетику, что может приводить к неоднозначности в экспериментальных данных. Являясь потенциальной мишенью для mdivi-1, динаминподобный белок Drp1 помимо обеспечения деления митохондрий участвует в механизмах эндоцитоза и оборота синаптических везикул, что подтверждают многочисленные исследования на генетических моделях. Кроме того, вызывает интерес сообщение о различии влияния mdivi-1 на морфологию митохондрий нейронов и астроцитов, что может иметь значение для глиальной поддержки нейротрансмиссии [34]. У мышей c дефицитом Drp1 были снижены синаптическая передача нейронов гиппокампа и биоэнергетические функции аксональных митохондрий [35, 36], уменьшалось число пресинаптических митохондрий и наблюдалась потеря дендритных шипиков [37]. При этом в более ранней работе у гетерозиготных нокаутных по Drp1 мышей изменения локализации и экспрессии синаптических белков не обнаружены [38]. Последнее не согласуется с выявленным нами снижением окрашивания на белок постсинаптической плотности PSD95 под действием mdivi-1 и подчеркивает, что результаты, получаемые на нокаутных животных, ограниченно применимы для объяснения эффектов фармакологического ингибирования Drp1 в силу компенсаторных процессов. Полученные в настоящей работе результаты могут объясняться как увеличением синтеза PSD95 в ответ на нарушения синаптической передачи, вызываемой mdivi-1, так и структурными изменениями области постсинаптического уплотнения, что требует дальнейших исследований.
По недавно опубликованным данным, активация Drp1 необходима для созревания синапсов [39]. Согласно ряду работ, Drp1 вносит вклад в формирование везикулярного пула в развивающихся синапсах и регулирует оборот синаптических везикул в пресинаптических и постсинаптических окончаниях гиппокампальных нейронов [16, 40]. Эти работы на нокаутных по Drp1 животных, демонстрирующие нарушение оборота синаптических везикул при недостаточности Drp1, согласуются с данными N. Marx et al. [13], которыми на культуре нейронов было показано снижение под действием mdivi-1 нейрональной активности и экспрессии синтаксина-4, белка SNARE комплекса, обеспечивающего слияние везикул с пресинаптической мембраной. Впрочем, последнее авторы объясняют нарушением энергетической функции митохондрий, а не влиянием mdivi-1 на везикулярный эндоцитоз.
Снижение иммуноокрашивания на синаптофизин, выявленное в нашей работе, может быть ассоциировано с влиянием mdivi-1 как на эндоцитоз везикул, так и на аксональную энергетику. Помимо этого, обнаруженное снижение синаптофизина в молекулярном слое может быть связано с уменьшением нейрогенеза и синаптогенеза нейронов гиппокампа.
Наряду с морфологическими изменениями mdivi-1 в проведенном исследовании оказывал влияние на тревожноподобное поведение грызунов. При интравентрикулярном введении mdivi-1 наблюдалась тенденция к увеличению времени нахождения в открытом рукаве в Т-образном лабиринте и центральной зоне в тесте «Открытое поле», что свидетельствует о снижении тревожности. Важно отметить, что при интраперитонеальном введении mdivi-1 такой эффект не наблюдался, что может быть связано с различиями в биодоступности mdivi-1 для структур мозга при разных способах введения и в целом подтверждается данными нашего исследования, в котором ряд изменений наблюдался в группе, получавшей mdivi-1 интраперитонеально, только на уровне тенденции. При этом наблюдаемые эффекты mdivi-1 на поведение не сопровождались изменениями в общей двигательной активности животных, что исключает возможность седативного действия препарата. Эти результаты согласуются с данными других немногочисленных исследований влияния mdivi-1на поведение. Так, в работе [41] по моделированию черепно-мозговой травмы указано, что внутрибрюшинное введение mdivi-1 контрольным животным не вызывало изменений в пройденной дистанции в тесте «Открытое поле».
Что касается влияния нокаута Drp1 на поведение, при частичном нокауте у мышей не было обнаружено отличий в двигательной активности и тесте распознавания объекта [42], а в другой работе [43] описаны различия нокаутных животных от мышей дикого типа по показателям в тесте Морриса, что может указывать на изменения функций гиппокампа. Интересно, что mdivi-1 отличался по поведенческими эффектам от менее селективного ингибитора Drp1 – динасора (Dynasore), ингибитора ГТФаз, для которого показаны сходные с mdivi-1 антиоксидативные и нейропротекторные эффекты, а также подавление нейрональной миграции [44, 45]. Введение динасора в стриатум ослабляло двигательную активность мышей в тесте «Открытое поле», но не влияло на тревожноподобное поведение [45]. Различия в эффектах mdivi-1 и динасора могут объясняться тем, что динасор ингибирует действие и других ГТФаз, участвующих в различных клеточных процессах.
Таким образом, в проведенном исследовании удалось продемонстрировать влияние mdivi-1 на митохондрии нейронов гранулярного слоя ЗИ гиппокампа, снижение нейрогенеза и дифференцировки нейрональных предшественников в субгранулярной зоне гиппокампа под действием mdivi-1, что сопровождалось изменениями иммуноокрашивания на синаптические белки в ЗИ гиппокампа, а также изменениями поведения животных.
Эффекты краткосрочного применения mdivi-1 сохранялись через 14 дней, а снижение дифференцировки нейрональных предшественников в гиппокампе незначительно зависело от способа введения препарата. Нельзя исключить, что помимо непосредственного влияния mdivi-1 выявленные перестройки синаптических структур в гиппокампе объясняются и ответом на подавление нейрогенеза в ЗИ, что требует дальнейшего изучения.
Множественность эффектов mdivi-1 и его влияние на нейрогенез следует учитывать при рассмотрении этого и подобных ингибиторов Drp1 в качестве потенциальных фармакологических препаратов и нейропротекторов при неврологических заболеваниях. Как показало наше исследование, ингибирование Drp1 вызывает перестройки биоэнергетики и морфологии митохондрий, изменяет организацию синаптических структур в гиппокампе, оказывает воздействие на дифференцировку и созревание нейронов, что может существенно влиять на ожидаемые эффекты препаратов, направленных на регуляцию митохондриальной динамики.
Авторы выражают благодарность Алине Вадимовне Чаплыгиной, научному сотруднику Института биофизики клетки Российской академии наук – обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», за помощь в проведении исследования.