заведующий морфологической лабораторией Института фундаментальной медицины (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
кандидат; профессор института фармации (Ханчжоуский педагогический университет)
доктор биологических наук; старший научный сотрудник отдела морфологии всероссийского центра глазной и пластической хирургии «Аллоплант» (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор биологических наук; ведущий научный сотрудник морфологической лаборатории Института фундаментальной медицины (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
младший научный сотрудник морфологической лаборатории Института фундаментальной медицины (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
младший научный сотрудник морфологической лаборатории Института фундаментальной медицины (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
ординатор кафедры патологической анатомии (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор медицинских наук, доцент; заведующий кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии (ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сердечно-сосудистые заболевания, среди которых лидирует ишемическая болезнь сердца, занимают ведущее место среди причин смертности населения в России и в мире [1]. Морфологическим субстратом ишемической болезни является выраженное в той или иной степени повреждение кардиомиоцитов вследствие нарушения кровотока в коронарных сосудах [2]. Кроме этого, при патоморфологическом исследовании приходится учитывать изменения в миокарде, связанные с проведенными при жизни кардиохирургическими операциями [3–6]. Диагностика раннего ишемического повреждения миокарда после смерти остается сложной задачей как для патологоанатомов, так и для судебно-медицинских экспертов [7]. Хотя при жизни можно выявлять изменения с помощью электрокардиографии (ЭКГ) или лабораторных тестов с использованием кардиоспецифических маркеров, таких как тропонин T, I и КФК-МВ, эти данные не всегда находят подтверждение при посмертном гистологическом исследовании на светооптическом уровне.
В патологоанатомической практике одним из основных методов выявления раннего ишемического повреждения кардиомиоцитов является комбинированное гистохимическое окрашивание гематоксилином – основным фуксином – пикриновой кислотой (ГОФП), описанное J.T. Liе и соавторами в 1971 году и названное ими фуксиноррагическим методом. Термин «фуксиноррагия» был предложен авторами как альтернатива термину «фуксинофилия», обозначающему известную реакцию Г. Селье на повреждение кардиомиоцитов с использованием в качестве красителя кислого фуксина. Результат реакции по методу Ли, или методу ГОФП, характеризуется красно-коричневым окрашиванием основным фуксином саркоплазмы ишемизированных кардиомиоцитов, тогда как интактные миоциты приобретают желтую окраску, иногда с зеленоватым оттенком. При этом размеры очагов красно-коричневых кардиомиоцитов коррелируют с развитием ишемии миокарда. Отмечено, что при наступлении некроза кардиомиоцитов фуксинофильный субстрат исчезает. Наиболее вероятным механизмом возникновения фуксинофильного субстрата считается взаимодействие фуксина как катионного красителя с продуктами распада гликогена в саркоплазме кардиомиоцитов с окрашиванием их в красно-коричневый цвет [8]. Метод окрашивания ГОФП имеет высокую специфичность в эксперименте [9].
Тем не менее существуют и критические оценки метода ГОФП. Некоторые авторы отмечают частые случаи ложноположительного и ложноотрицательного окрашивания, а также неравномерное распределение красителя фуксина в нормальных тканях [10, 11].
Обнаружено несколько факторов, существенно влияющих на положительный результат реакции при окрашивании по методу ГОФП: аутолиз ткани в аутопсийном материале, время фиксации и толщина срезов [12]. Воспроизводимость окрашивания и достижение высокого уровня согласованности в интерпретации результатов возможны только при использовании тщательно стандартизованных процедур. Изложенное выше, а также результаты собственных исследований позволили сделать вывод, чтоприменение одного критерия для диагностики раннего инфаркта миокарда и/или ишемического повреждения кардиомиоцитов не может решить диагностическую проблему.
Современные методы, такие как иммуногистохимия [13], поляризационная микроскопия [14] и т.п., значительно повышают диагностические возможности патологоанатомического исследования, однако их применение в повседневной практике сопряжено с определенными трудностями.
Представляется целесообразным дополнить метод ГОФП таким же доступным и информативным гистохимическим методом. Наше внимание привлек метод окрашивания трихромом по Маллори, в котором в отличие от ГОФП используется не основной, а кислый фуксин [10]. Как отмечено выше, для выявления фуксинофильного субстрата в кардиомиоцитах изначально использовался кислый фуксин в окрашивании по Селье. Позже J.T. Liе подтвердил, что окрашивание кислым фуксином способно определять поврежденные участки миокарда в эксперименте, однако специфика окрашивания требует подтверждения [15].
Окрашивание по Маллори широко распространено, используется преимущественно для выявления компонентов соединительной ткани [16] и для идентификации ранней ишемии кардиомиоцитов ранее не применялось.
Цель исследования – провести сравнительный анализ информативности методов ГОФП и окрашивания по Маллори при выявлении ранних ишемических повреждений миокарда.
Исследование выполнено с использованием аутопсийного и экспериментального материала. Аутопсийный материал (23 случая) пациентов с различными нозологическими формами, преимущественно сопровождающимися острой сердечной недостаточностью, был получен из архива патологоанатомического отделения городской клинической больницы № 21 Уфы. Для верификации ложноположительных результатов вследствие аутолиза ткани во всех случаях учитывалось время, прошедшее после смерти до момента аутопсии. Основным диагнозом в 10 случаях был инфаркт миокарда, в семи – постинфарктный кардиосклероз, в шести – другая нозологическая форма. Во всех случаях в клинике фиксировалась острая сердечная недостаточность с помощью функциональных методов (ЭКГ, эхокардиография) и лабораторных исследований (миоглобиновая фракция креатинкиназы, тропонины I, T). Вскрытие проводилось в промежутке от 12 до 48 часов с момента наступления биологической смерти, при этом для исследования брали от двух до четырех кусочков миокарда.
Экcпeримeнтaльнaя рaбoтa выполнена нa 50 бeлых бecпoрoдных пoлoвoзрeлых самцах крыc (225,7±22,4 грамма), которые содержались в условиях вивария Башкирского государственного медицинского университета при комнатной температуре и обычном рационе с неограниченным доступом к питьевой воде в соответствии с санитарно- эпидемическими правилами СП 2.2.1.3218-14 с соблюдением международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 1986), утвержденных правил проведения лабораторных доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ 3 51000.3-96, ГОСТ 51000.4-96, ГОСТ 50258-92) и лабораторной практики (приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н). Исследования одобрены этическим комитетом Башкирского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 12.10.2020, протокол № 63 от 22.08.2022).
Для получения экспериментального материала были проведены два вида исследований, отличающихся воспроизведением ишемического воздействия на миокард. В первом эксперименте у 22 крыс воспроизводили ишемию миокарда прекращением перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа [17], а во втором у 28 крыс воспроизводили физическую нагрузку на миокард методом принудительного плавания с грузом до полного утомления [18].
Методика первого эксперимента заключалась в следующем. Животным под тиопенталовым наркозом («Синтез АКО ОАО», Россия) была проведена операция по выделению магистральных сосудов сердца. Затем орган извлекали и помещали в раствор Кребса–Хензелайта и карбогеном [17] с последующим подключением к системе для перфузии («КардиоПротект», Россия). После стабилизационного периода начинался 30-минутный период ишемии, далее перфузия возобновлялась на 2 часа. После реперфузии сердце фиксировали в растворе 10% забуференного нейтрального формалина («БиоВитрум», Россия), а зону ишемии определяли макроскопически с помощью трифенилтетразолия хлорида («ЛенРеактив», Россия). Суть второго эксперимента – принудительное плавания крыс с грузом до полного утомления как модель анаэробной физической нагрузки, при которой преимущественно используется гликолиз как источник энергии, и в крови растет уровень лактата. Этот тест проводили ежедневно в течение 30 дней утром, с 09:00 до 11:00. Масса груза составляла 10% от массы тела крыс. В качестве наркоза использовали хлоралгидрат («Химпром-М», Россия), извлекали сердца после инсуфляции летальной дозы паров хлороформа («ЭКОС-1», Россия).
Сердца фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине («БиоВитрум», Россия). Для патогистологического исследования вырезали пять поперечных сегментов миокарда, которые затем подвергали стандартной проводке в изопропиловом спирте («БиоВитрум», Россия) и уплотнению ткани в парафине «гистомикс» («БиоВитрум», Россия). Срезы из одной парафиновой ленты окрашивали по методу ГОФП («БиоВитрум», Россия) и трихромом по Маллори («БиоВитрум», Россия). Готовые стеклопрепараты были отсканированы на Pannoramic 250 (3DHISTECH Ltd, Венгрия) с последующим изучением гистологических срезов при разном увеличении с помощью программы CaseViewer (3DHISTECH Ltd, Венгрия). В микропрепаратах, окрашенных ГОФП и трихромом по Маллори, определяли выраженность повреждения миокарда полуколичественным методом: 0 баллов – интактный миокард, 1 балл – минимальная выраженность (<26% миокарда), 2 балла – от минимального до умеренного уровня (26–50% миокарда), 3 балла – умеренный уровень (51–75% миокарда), 4 балла – тяжелое повреждение (>75% миокарда) [19].
Статистический анализ данных выполняли в программе Statistica 12 (StatSoft Inc., США). Для выявления нормального распределения количественные показатели оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для оценки различий между группами использовали критерии χ2 Пирсона.
Анализ экспериментального и аутопсийного материала показал, что ишемически измененные кардиомиоциты при окрашивании по методу ГОФП содержали фуксинофильный субстрат с типичной красно-коричневой окраской. Интактные миоциты окрашивались в желтый цвет. При использовании трихрома по Маллори ишемизированные кардиомиоциты имели красно-оранжевую окраску, интактные мышечные волокна окрашивались в пурпурно-фиолетовый цвет (рис.).
На аутопсийном материале при окрашивании по ГОФП в 14 случаях ишемические повреждения кардиомиоцитов не выявлены (0 баллов), в восьми случаях наблюдается минимальная выраженность повреждения (1 балл), в одном случае – от минимального до умеренного уровня (2 балла). При окрашивании трихромом по Маллори патология не была выявлена в 10 случаях (0 баллов), в 12 случаях – 1 балл, в одном случае – 2 балла. Таким образом, в 17 случаях оценки по баллам совпадали между двумя методами, а в 4 случаях наблюдалось расхождение, причем при окрашивании по методу ГОФП оценки составляли 0 баллов, а при трихроме по Маллори – 1 балл. Критерий χ² Пирсона не выявил статистически значимой разницы между показателями окрашивания (p=0,475).
При исследовании миокарда перфузируемого сердца были получены следующие результаты. В срезах, окрашенных с применением методов ГОФП и Маллори, кардиомиоциты с признаками ишемического повреждения выявлялись очагово в субэпикардиальной зоне миокарда и были диффузно распределены в субэндокардиальной зоне. При оценке выраженности повреждения в баллах результаты совпадали полностью.
При окрашивании сердца крыс с вынужденной физической нагрузкой обоими методами положительная гистохимическая реакция отмечалась преимущественно в субэпикардиальной зоне миокарда. В участках окрашивания продемонстрирована фуксинофилия. Количество баллов при подсчете выраженности повреждения миокарда совпадало.
В таблице представлены результаты количественной оценки чувствительности и специфичности обоих методов в группах аутопсийного и экспериментального материала. Из представленных данных видно, что на аутопсийном материале окрашивание трихромом по Маллори обладает более высокой чувствительностью, однако оба метода демонстрируют относительно низкие показатели, что может быть связано с началом аутолиза ткани. Напротив, при экспериментальных моделях окрашивание одинаково высокочувствительно и высокоспецифично.
В результате проведенного исследования установлено, что окрашивание по Маллори так же, как и по методу ГОФП, позволяет выявить фуксинофильный субстрат, указывающий на ишемическое контрактурное повреждение кардиомиоцитов различного происхождения, как на аутопсийном, так и на экспериментальном материале. Кардиомиоциты, положительно окрашенные по методу ГОФП, имеют красно-коричневый цвет на фоне интактного желтого, при окрашивании трихромом по Маллори – красно-оранжевый цвет на фоне пурпурно-фиолетового. На представленном нами аутопсийном материале окрашивание по методу ГОФП и трихромом по Маллори демонстрирует фуксинофилию, выраженную примерно в равной степени. Отмеченная нами несколько более высокая частота положительных результатов при окрашивании по Маллори требует дальнейшего статистического подтверждения. Оба метода при окрашивании аутопсийного материала при сравнении с экспериментальным находятся в границах низкой чувствительности диагностического теста. В экспериментальных моделях ишемического повреждения различного генеза наблюдается положительное гистохимическое окрашивание, обладающее высокой чувствительностью и специфичностью (96,88 и 92,31%, соответственно) и выраженное в равной степени для обоих методов.
Результаты приведенного исследования свидетельствуют о том, что окрашивание трихромом по Маллори может служить дополнительным методом, уточняющим степень ишемических повреждений миокарда при исследовании аутопсийного и экспериментального материала. Для экспериментального материала этот метод более информативен, чем для аутопсийного. Метод Маллори помимо верификации ранней ишемии дает возможность оценить фиброзные изменения, характеризующие хроническую ишемию миокарда. При этом метод хорошо воспроизводим и доступен в каждодневной практике.