Введение

Строение глазного яблока, в частности глазного дна, имеет ряд отличительных структурно-функциональных особенностей, о которых широкий круг патоморфологов осведомлен недостаточно.

Известно, что ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) как структура представлен неоднородным монослоем, включающим 4–6 млн гексагональных клеток с выраженной пигментацией, находящихся между нейросенсорным апикальным слоем сетчатки и базально расположенной сосудистой оболочкой. Слои соединены между собой плотными контактами [1–6]. Основания клеток РПЭ размещаются на базальной мембране, граничащей с мембраной Бруха сосудистой оболочки [5]. Клетки РПЭ взрослого человека располагаются в пределах сетчатки неоднородно. Они различаются размерами (в среднем около 10 мкм), содержанием пигмента, формой апикальных отростков и синтезом ряда белков (RPE65, Vimentin, CRALBP, PAX6 и др.). Кроме того, важно отметить, что клетки РПЭ обладают низким уровнем митотической активности [7].

Одной из наиболее часто встречающихся патологий РПЭ является возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – хроническое заболевание центральной зоны сетчатки, характеризующееся тенденцией к медленному прогрессирующему снижению зрения [6, 8].

Об актуальности вопросов диагностики и терапии патологии РПЭ свидетельствуют статистические данные, согласно которым в Российской Федерации более 14% населения старше 40 лет страдают от ВМД. В США в данной возрастной категории у 11,64% выявлена ранняя стадия ВМД, у 0,94%– поздняя [9]. В близкой возрастной категории, старше 45 лет, среди населения Китая распространенность ВМД составляет 5,88%, а среди людей старше 65 лет 16,83% [10]. В условиях интенсивного развития современных методов исследования РПЭ и совершенствования протоколов лечения наблюдается стремительное увеличение числа выявленных случаев патологии РПЭ.

Патогенез ВМД в настоящее время по-прежнему остается предметом дискуссий в научном сообществе. Известно, что ВМД характеризуется комплексным мультифакторным патогенезом, связанным с возрастными дегенеративными процессами, экологическим риском и генетической восприимчивостью [11].

Оптимальной тактикой терапии патологии сетчатки, в частности ВМД, является трансплантация культуры клеток РПЭ в форме суспензии или клеточного монослоя на мембране Бруха через трансцилиарный либо транссклеральный доступ [12–17]. Тем не менее в рамках достижения наиболее благоприятных результатов трансплантации необходимо сформировать целостное представление о РПЭ, а именно охарактеризовать культуру клеток и определить присутствие специфических маркеров, подтверждающих наличие истинного функционально активного РПЭ. Представляются значимыми ранняя диагностика заболеваний РПЭ и, как следствие, своевременное начало патогенетически ориентированного лечения.

В связи с интенсивным развитием современных диагностических технологий заболевания пигментного слоя сетчатки диагностируются существенно чаще, что обусловливает высокий научный интерес к данному направлению и требует его активного изучения [8].

Строение РПЭ обладает специфическими характеристиками. РПЭ контактирует с дистальной частью наружных сегментов нейросенсорных клеток. Одна клетка соприкасается с 30–45 наружными сегментами фоторецепторов. Наружный сегмент каждой из палочек окружен отростками пигментных клеток (3–7 штук), содержащими органеллы общего назначения, меланосомы и фагосомы. Наружный сегмент колбочки, в свою очередь, окружен более длинными отростками (30–40 штук), содержащими меланосомы.

На апикальной поверхности клеток РПЭ расположены микроворсинки следующих типов:

а) длинные – находятся между наружными сегментами нейросенсорных клеток;

б) короткие – соединены с концами наружных сегментов нейросенсорных клеток [7].

РПЭ обладает депонирующими свойствами. Так, в его клетках осуществляется накопление меланосом, а также липофусцина и меланолипофусцина, обладающих свойством аутофлюоресценции, что имеет большое диагностическое значение при исследовании глазного дна [9, 18]. Также диагностически значима высокая отражающая способность внешней ограничивающей мембраны и митохондрий внутреннего сегмента описанных клеток, что определяется при спектральной доменной оптической когерентной томографии (spectral-domain optical coherence tomography, SD-OCT) [19].

Кроме того, даже в условиях однослойного строения РПЭ структурно-функциональные особенности клеток варьируют в зависимости от положения объекта относительно макулы [20]. К таким особенностям можно отнести следующие:

клетки РПЭ, расположенные рядом с центральной ямкой (fovea centralis), характеризуются меньшим диаметром и обладают большим количеством гранул липофусцина [20, 21];

зачастую клетки РПЭ имеют несколько ядер, что наиболее выражено в области, прилежащей к центральной ямке [22];

непосредственно в центральной ямке количество клеток РПЭ крайне мало – данная группа практически отсутствует [22].

С целью исследования структурно-функциональных особенностей РПЭ сегодня применяются различные морфологические методы исследования.

Гистологический метод характеризует структурные особенности РПЭ в виде неоднородного однослойного образования, представленного гексагональными поляризованными пигментированными клетками с низкой митотической активностью, кубической или цилиндрической формы, с низким уровнем пролиферативной активности и неодинаковой степенью дифференцировки (более дифференцированными чаще являются клетки центральной области сетчатки) [5].

Флюоресцентный иммуноцитохимический анализ в срезах РПЭ, полученными от плодов человека и взрослых людей, а также в клеточных культурах дедифференцированных клеток РПЭ осуществляли с использованием антител к маркерам ряда белков. Срезы РПЭ берут с заднего сегмента глазного яблока после предварительной фиксации в 10% растворе формалина.

А) Маркеры РПЭ

CRALBP – клеточный ретинальдегидсвязывающий белок, характерный маркер РПЭ. При анализе РПЭ плодов человека обнаружен в большинстве клеток эпителиальной морфологии, а при анализе РПЭ взрослых людей он наблюдался в единичных клетках первичных и пассируемых культур. Предполагается, что данный белок принимает непосредственное участие в осуществлении сетчаткой фоторецепторной функции, а именно в работе палочек и колбочек [23]. Значимой также представляется связь между экспрессией белка и процессами клеточного глиоза [24].

RPE65 – маркерный белок для РПЭ, участвующий в регенерации светочувствительного пигмента. В первичной культуре синтез RPE65 практически прекращался [5]. Отсутствие реакции на этот белок демонстрирует утрату клеткой свойств, характерных для эпителиальной группы [25].

Б) Маркеры нейронов и нейроглии

ßIII-тубулин – маркер ранних нейронов. Реакция на этот белок отмечалась в единичных клетках фибробластоподобной морфологии распластанной и биполярной формы, в некоторых из них были сохранны единичные меланиновые гранулы [5, 26].

Нейрональный кадгерин (N-cadherin) – кальцийзависимый белок клеточной адгезии. Наблюдалось позитивное окрашивание в эпителиоподобных клетках культуры, в области межклеточных контактов, цитоплазме фибробластоподобных клеток [5, 27].

Нестин (Nestin) – белок-маркер нейроэпителиальных и нейральных стволовых клеток. Отмечается позитивное окрашивание многочисленных вытянутых, биполярных клеток во всех случаях. Кроме того, по результатам двойного окрашивания антителами к Ki67 и нестину отмечалась активная пролиферация именно среди нестинпозитивных клеток [5, 28].

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) – маркер повреждения глиальных клеток, клеточного глиоза. Отмечены немногочисленные популяции позитивно окрашенных глиальных клеток в каждом из образцов культивируемых клеток РПЭ [5, 29].

В) Маркеры пролиферации и регенерации

Кi67 – белок клеточной пролиферации. Явная положительная реакция с последующим снижением числа окрашенных клеток по мере пассирования. В связи с более интенсивной пролиферацией в группе фибробластоподобных клеток окрашивание более интенсивное в сравнении с эпителиальными [5, 30].

BDNF (нейротрофический фактор мозга) является регулятором для нейральных стволовых клеток и их дифференцировки в нейральном направлении. В эксперименте было показано, что BDNF значительно увеличивает экспрессию ßIII-тубулина в эпителиоподобных клетках в среде без сыворотки, а с 1% сывороткой FBS клетки приобретают фибробластную структуру [31].

CNTF (цилиарный нейротрофический фактор) определяет процесс дифференцировки клеток главным образом в глиальном направлении. Не выявлено влияние CNTF на изменение числа ранее описанных GFAP+ клеток, однако отмечено усиление дифференцировки эпителиоподобных клеток в нейроны (вероятно, амакриновые дофаминергические) [32].

Г) Маркеры клеточной адгезии и межклеточных взаимодействий

Фибронектин (Fibronectin) – маркер клеточной дифференцировки, белок, регулирующий клеточную пролиферацию. Определяется немногочисленная популяция позитивно окрашенных клеток, синтезирующих указанный белок [5, 33].

Connexin 43 (Сх43) – белок щелевых контактов. При анализе РПЭ у плодов человека этот белок обнаружен в эпителиальных клетках (по всему их контуру), тогда как при анализе РПЭ у взрослых людей его продуцировали лишь единичные фибробластоподобные клетки [5, 34].

Д) Маркеры цитоскелета и клеточной структуры

Виментин (Vimentin) – белок промежуточных филаментов тканей мезодермального происхождения. Практически все клетки окрашивались позитивно [5, 26]. Фиксировалась тенденция к наиболее высокой экспрессии в клетках Мюллера [35]. Значимым также представляется участие виментина в прогрессировании патологического процесса фибротического ремоделирования [26].

Е) Другие маркеры

Рах6 (транскрипционный фактор) – в норме участвует в поддержании мультипотентного состояния пролиферирующих клеток-предшественников сетчатки. При анализе РПЭ у плодов человека антитела к Рах6 не окрашивали клетки ни в одной из исследованных культур, тогда как в анализе РПЭ у взрослых людей отмечались единичные случаи окрашивания, чаще всего в клетках фибробластоподобной морфологии, реже в клетках с эпителиальным фенотипом [5, 36, 37].

Рековерин (RCVRN) – фоторецепторный маркер, при двойном окрашивании в некоторых культурах клеток обнаружены ßIII-тубулин+ клетки, которые окрашивались также антителами на рековерин [5, 33]. В культуре клеток имели место активная пролиферация и утрата пигментации, что приводило к практически полной депигментации клеток с эпителио- и фибробластоподобной морфологией. Реакция на ßIII-тубулин свидетельствует о способности клеток к дифференцировке в нейрональном направлении, а на рековерин – о способности к дифференцировке в фоторецепторы.

Регулирование процесса дифференцировки осуществляется bFGF – основным фактором роста фибробластов, ингибирующим дифференцировку и стимулирующим пролиферацию.

Таким образом, по данным иммуногистохимической оценки фенотипических характеристик, в РПЭ человека были отмечены признаки нейральной и глиальной дифференцировки в связи с позитивным диагностическим окрашиванием на глиальный маркер GFAP, нейрональный маркер ßlll-тубулин, а также специфические маркеры различных постмитотических ретинальных нейронов и рековерин [5, 8].

Оптическая когерентная томография (ОКТ). ОКТ-ангиография, выполненная в режиме En Face, предполагающем угловую визуализацию сосудистой структуры сетчатки, позволяет определить специфику морфологической структуры РПЭ в условиях неинвазивного доступа, с четкой топографической локализацией относительно ретинальной сосудистой сети. В РПЭ при помощи указанного метода с использованием флюоресцентной ангиографии определялись точки фильтрации и зоны диффузного просачивания красителя. Следовательно, данный метод позволяет определить локализацию дефектов и отслоения пигментного эпителия, визуализированных в качестве гипорефлективных участков [34–37].

Морфологическая оценка РПЭ при аутофлюоресценции является одним из значимых методов в диагностике его заболеваний. При помощи аутофлюоресценции через середину центральной ямки сетчатки может быть осуществлена оценка горизонтального и вертикального размера атрофического очага на ретинальном пигментном эпителии. В рамках данного способа исследования дистрофические очаги представляются в виде зон абсолютной гипофлюоресценции. В случае наличия зон частичной атрофии вокруг очага измеряют наибольший размер повреждения. Метод считается существенно более объективным и достоверным в сравнении с офтальмоскопией [1, 37, 38].

Метод RPS-Net – нейронная сеть, предназначенная для субъективной оценки размера, локализации и количественных характеристик ретинального пигментного эпителия. Исследования структурных особенностей сетчатки проводят посредством сегментации изображений при помощи цветовых параметров [39–41].

Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использован в рамках диагностических исследований для оценки экспрессии генов в тканях глаза живых организмов (например, гена, кодирующего белок VEGF-A) [42, 43]. В основу подхода к изучению механизмов репрограммирования РПЭ и регенерации сетчатки легла гипотеза сходства регуляторных механизмов, контролирующих процессы развития и регенерации одноименных тканей. Впервые с использованием метода ОТ-ПЦР и гибридизации in situ в регенерирующей сетчатке взрослых идентифицировали гены Pax6, Prox1 и Six3, принадлежащие регуляторной сети, контролирующей процессы развития тканей глаза. С внедрением в исследование методов полимеразной цепной реакции удалось получить более полную картину динамики экспрессии изучаемых генов на последовательных стадиях регенерации, начиная с ранних. Так, с помощью ОТ-ПЦР было показано, что активация генов Pax6, Six3, FGF2 происходит на фоне подавления уровня экспрессии мРНК-регуляторного гена Otx2, контролирующего исходную меланогенную дифференцировку клеток РПЭ, а также гена-маркера дифференцировки РПЭ – RPE65 [38, 44–46].

Заключение

Современные способы исследования ретинального пигментного эпителия включают в себя помимо традиционных гистологических методик флюоресцентный цитохимический анализ, оптическую когерентную томографию, изучение аутофлюоресценции ретинального пигментного эпителия, сегментацию проекции изображения сетчатки и полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией. Методы оптической когерентной томографии и сегментации проекции изображения сетчатки считаются высокотехнологичными и наименее инвазивными среди других перечисленных подходов. В то же время иммуногистохимические методы предлагают широкий выбор антител, подходящих под различные задачи, и могут использоваться в комбинации с культивированием тканей. Новые методические подходы к изучению ретинального пигментного эпителия позволяют наряду с раскрытием структурно-функциональных особенностей успешно диагностировать варианты его заболеваний, а также ориентировать клиницистов на поиск наиболее адекватных методов лечения.