Введение

Пограничная серозная опухоль яичника в настоящее время считается неинвазивным новообразованием с низким потенциалом злокачественности, индолентным течением и высокой выживаемостью [1]. Частота встречаемости пограничной серозной опухоли составляет 9–15% среди всех серозных новообразований яичников и чаще всего выявляется на ранней стадии заболевания [1, 2].

Тем не менее у пациенток с пограничной серозной опухолью отмечен более высокий риск прогрессирования в серозную карциному низкой степени злокачественности по сравнению с общей популяцией [3–5]. Проведен ряд продольных исследований, в которых сообщалось о факторах риска развития последующего серозного рака низкой степени злокачественности [5–7]. Среди них – наличие опухоли на поверхности яичника, двусторонняя локализация новообразования, стадия >I по классификации Международной федерации гинекологии и акушерства (International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO), наличие резидуальной опухоли, а также микропапиллярный паттерн роста. Тем не менее серозная карцинома низкой степени злокачественности может возникать через несколько лет после пограничной серозной опухоли, несмотря на отсутствие признаков, увеличивающих риск прогрессирования [5].

В последнее время некоторые исследователи пытались описать роль молекулярных событий, ответственных за возникновение и прогрессирование пограничной серозной опухоли [8, 9]. Большинство опухолей содержит мутации в сигнальном пути митогенактивируемой протеинкиназы (mitogen-activated protein kinase, MAPK) (например, BRAF или KRAS). Тогда как опухоли с мутацией KRAS, как правило, связаны с рецидивом и прогрессированием в карциному, мутация BRAF является значимым прогностическим фактором благоприятного течения заболевания [8, 9].

Уже показано, что существует взаимосвязь между мутацией BRAF и специфическим гистологическим признаком – эозинофильными клетками (ЭК) [10]. ЭК можно охарактеризовать как стареющие клетки с обильной эозинофильной цитоплазмой, которые возникают в результате активации онкогена и развития онкогениндуцированной сенесценции [10].

На основании сказанного выше можно предположить, что мутация BRAF препятствует последующему прогрессированию пограничной серозной опухоли в серозную карциному низкой степени злокачественности, а ЭК могут быть потенциальным маркером этого генетического драйвера.

Таким образом, целью настоящего исследования было определение клинико-морфологических, иммунофенотипических и молекулярно-генетических особенностей пограничных серозных опухолей яичника.

Материалы и методы

В исследование было включено 63 случая пограничной серозной опухоли яичников, верифицированных патологоанатомами 1-го патологоанатомического отделения НМИЦ АГП имени В.И. Кулакова на основании критериев, предложенных в классификации опухолей женской репродуктивной системы Всемирной организацией здравоохранения в 2020 году [2], от пациенток в возрасте от 15 до 79 лет, которым выполнено оперативное лечение в период с 2018 по 2023 год. Средний возраст пациенток составил 39,7±14,7 года (95% ДИ 35,9–43,4). Исследование одобрено комиссией по этике НМИЦ АГП имени В.И. Кулакова (протокол № 3 от 21.03.2024).

Для микроскопического исследования фрагменты опухолевой ткани фиксировались в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 часов. Затем образцы были обезвожены в автоматическом режиме при помощи гистологического процессора замкнутого цикла с вакуумом TissueTek VIP 5 (Sakura, Япония), залиты в парафин «Гистомикс Экстра» («БиоВитрум», Россия). Из парафиновых блоков получены срезы толщиной 5 мкм, которые нанесены на предметные стекла. С помощью аппарата для автоматического окрашивания Leica Autosteiner XL ST5010 (Leica, Германия) стекла были окрашены гематоксилином и эозином. Анализ микропрепаратов проводили с помощью световых микроскопов Leica DM 2500 (Leica, Германия) при увеличении ×10–400.

Иммуногистохимическое исследование с антителами к рецепторам эстрогена (клон SP1, Ventana, Roche Diagnostic, Швейцария), прогестерона (клон 1Е2, Ventana, Roche, Швейцария), маркера пролиферативной активности Ki67 (клон 30-9, Ventana, Roche Diagnostic, Швейцария) и р16 (CINtec, Ventana, Roche Diagnostic, Швейцария) выполнено при помощи иммуностейнера BenchMark XT (Ventana, Roche Diagnostic, Швейцария) с использованием стандартных протоколов (температура инкубации +37°, время инкубации от 16 до 24 минут), панели детекции ultraView Universal DAB (Ventana, Roche Diagnostic, Швейцария).

Для иммуногистохимических маркеров рецепторов эстрогена и прогестерона был определен показатель H-score (Histoscore) по формуле:

HS = 1а + 2b + 3c,

где а – процент слабо окрашенных клеток, b – процент умеренно окрашенных клеток, с – процент сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания в баллах.

Ki67-позитивную пролиферирующую фракцию клеток опухоли определяли усредненным методом.

Все микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином, были проанализированы на предмет наличия ЭК. Для верификации истинных эозинофильных клеток использовали иммуногистохимический метод с маркером р16 (рис. 1).

Анализ мутаций проводился методом таргетного высокопроизводительного секвенирования (NGS) ампликонов на секвенаторе FASTASeq 300 (GeneMind Bioscience, Китай). Для генетического анализа использовали специфичные праймеры для KRAS (экзоны 2, 3 и 4), NRAS (экзоны 2, 3 и 4) и BRAF (экзон 15), подобранные с помощью программ PrimerPlus и PrimerSelect (пакет программ DNASTAR).

Для статистической обработки данных использовали программы GraphPad Prism 9.3.1 (Dotmatics, США) и StatTech v3.0.6 («Статтех», Россия). Исследуемые количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Сравнение трех и более групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполнялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа, апостериорные сравнения проводились с помощью критерия Тьюки (при условии равенства дисперсий). Сравнение групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения – с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных и многопольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью F-критерия Фишера и χ2 Пирсона, соответственно. Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода применялся метод анализа ROC-кривых. Оценку функции выживаемости пациенток проводили по методу Каплана–Мейера. С целью оценки внутренней согласованности результатов теста для выявления ЭК использовалась каппа Флейсса (ϰ).

Результаты

По результатам генетического тестирования выявлено, что более чем в половине пограничных серозных опухолей (63,5%) определялись мутации MAPK-сигнального пути (рис. 2).

В кодирующей ДНК (кДНК) чаще всего встречались мутации BRAF, состоящие из нуклеотидной замены c.1799T>A (преимущественно) и нуклеотидной замены c.1781A>G (табл. 1). В девяти случаях обнаружены мутации KRAS, представленные нуклеотидными заменами c.35G>C, c.35G>T, c.35G>A, c.183A>C и c.34G>T. В одной пограничной серозной опухоли яичника обнаружена NRAS-мутация, представленная нуклеотидной заменой c.182A>G.

Пациентки с мутациями BRAF на момент выполнения им операции были моложе, чем пациентки с опухолями дикого типа и опухолями, имеющими мутации KRAS, NRAS, однако эти различия не были статистически значимы (р=0,16).

Для восьми случаев информация о стадии FIGO была недоступна из-за неполного объема оперативного вмешательства в связи с отсутствием срочного гистологического исследования замороженных срезов опухоли. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что из 55 пограничных серозных опухолей стадия по FIGO >I выявлялась в 11% BRAF-мутантных (две – V600E и одна – Asp594Gly), 66,7% KRAS-мутированных опухолей и 50,0% опухолей дикого типа. Следовательно, пограничные серозные опухоли с мутацией BRAF реже имели неинвазивные импланты в сальнике и брюшине по сравнению с другими опухолями (р=0,04).

При анализе экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона и Ki67 в зависимости от мутационного статуса опухоли нам не удалось установить статистически значимые различия (табл. 2).

Для оценки значимости H-score для рецепторов эстрогена, прогестерона и Ki67 при прогнозировании рецидива заболевания применялся метод анализа ROC-кривых (табл. 3).

Так, для рецепторов эстрогена пороговое значение в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 290 (чувствительность 100% и специфичность 35,4%), для рецепторов прогестерона – 110 (чувствительность 50% и специфичность 87,9%), для маркера пролиферативной активности – 7 (чувствительность 75% и специфичность 71,2%).

Данные по безрецидивной выживаемости были получены для 25 пациенток (рис. 3). При анализе безрецидивной выживаемости с краткосрочным периодом наблюдения (до 30 месяцев) у трех пациенток в группе с мутацией BRAF был выявлен рецидив опухоли. При анализе безрецидивной 5-летней выживаемости из 10 случаев обнаружен один рецидив у пациентки с KRAS-мутированной опухолью. Статистически значимые различия при оценке вероятности возникновения рецидива в зависимости от мутационного статуса опухоли получены не были (р=0,56).

Вероятность возникновения рецидива при расчете с помощью метода Каплана–Майера в зависимости от уровня экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов была выше при значении H-score менее 110 для прогестерона и менее 290 для эстрогена (рис. 3), однако эти результаты не были статистически значимы (р=0,23 и р=0,21, соответственно). При анализе вероятности возникновения рецидива в зависимости от Ki67 обнаружены статистически значимые различия (р=0,04). Так, вероятность возникновения рецидива в зависимости от индекса пролиферативной активности была выше при значении Ki-67 ≥7% (рис. 3).

В микропрепаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, сенесцентные клетки идентифицированы всеми (3/3) или большинством патологоанатомов (2/3) в 74% BRAFV600E-мутированных опухолях (рис. 4) и в 96% случаев при их верификации с помощью иммуногистохимического метода и антитела к р16. В одном случае опухоли с мутацией BRAFV600E ЭК не были обнаружены. Таким образом, чувствительность и специфичность прогнозирования мутации BRAF для ЭК составила 96,3 и 88,9%, соответственно. Положительная прогностическая значимость ЭК составила 86,7%, отрицательная прогностическая значимость 97%. В трех образцах с мутацией BRAFp.Asp594Gly истинные ЭК не обнаружены.

Обсуждение

В настоящее время известно, что мутации BRAF и KRAS являются важными драйверами онкогенеза пограничных серозных опухолей и связаны с сигнальным путем митогенактивируемой протеинкиназы и неконтролируемой пролиферацией [1, 8, 9]. Так, например, пограничные серозные опухоли с мутацией KRAS чаще прогрессируют в серозную карциному яичника низкой степени злокачественности [9]. С другой стороны, было показано, что наличие в пограничных серозных опухолях мутации BRAF ассоциировано с благоприятным прогнозом и низким риском прогрессии в серозную карциному низкой степени злокачественности посредством активации генов-супрессоров опухоли и формирования онкогениндуцированной сенесценсии [8, 11]. Следствием последнего является появление ЭК с сенесцентным фенотипом [12].

ЭК были впервые описаны при серозных пограничных опухолях в качестве одного из паттернов стромальной микроинвазии, а также в лимфатических узлах, пораженных клетками серозной пограничной опухоли [13, 14]. Поскольку микроинвазия и поражение лимфатических узлов не были связаны с неблагоприятными клиническими исходами, K. Maniar et al. предположили, что эти ЭК являются стареющими, окончательно дифференцированными клетками [15]. Впоследствии F. Zeppernick et al. пришли к выводу, что эти специфические по своим морфологическим свойствам клетки преимущественно обнаруживаются в серозных пограничных опухолях с мутацией BRAF, хотя в редких случаях могут встречаться и в серозных пограничных опухолях дикого типа [10].

Остается не до конца изученным, как именно ЭК приобретают свой форм-фактор. Увеличение размеров клеток и обильная эозинофильная цитоплазма, связанные со старением, вероятно, вызваны несколькими механизмами. Во-первых, это может быть ассоциировано со снижением активности протеасомальных пептидаз и нарушением работы убиквитин-протеасомной системы деградации белков [16, 17]. В результате происходит избыточное накопление окисленных и убиквитинированных дисфункциональных белков в цитоплазме клетки. Во-вторых, нарастание биоэнергетического дефицита может привести к сдвигу динамики митохондрий в сторону слияния и образования мегамитохондрий [18].

Кроме того, неизвестно как пограничные серозные опухоли с мутацией BRAF и онкогениндуцированной сенесценцией преодолевают старение, остановку клеточного цикла и продолжают прогрессировать до серозной карциномы. Высказано предположение, что наличие дополнительных мутаций-«модификаторов» может способствовать прогрессированию новообразования. В 2015 году F. Zeppernick et al. провели углубленный анализ этого парадокса и показали потенциальную роль делеций ch1p36 и ch9p21 в морфогенезе от пограничной серозной опухоли к серозной карциноме низкой степени злокачественности, так как эти участки кодируют белки-супрессоры опухолей [16].

Прогрессирование опухоли может быть также связано с изменением в метаболизме глюкозы. Опираясь на эту концепцию, K. Aird et al. смогли показать, что добавления избыточного количества экзогенных нуклеозидов достаточно, чтобы преодолеть остановку роста клеток, связанную с онкогениндуцированной сенесценцией [19]. Также известно, что мутация BRAF вызывает активацию транспортера глюкозы-1 (GLUT1), которая приводит к увеличению метаболизма глюкозы, необходимого для преодоления клеточного старения и, следовательно, прогрессирования опухоли [16].

В нашей работе показано, что сенесцентные клетки с обильной эозинофильной цитоплазмой и выраженной ядерно-цитоплазматической экспрессией р16 были ассоциированы с пограничными серозными опухолями с мутацией BRAF и их определение в ткани пограничных опухолей продемонстрировало значительную чувствительность и специфичность (96,3 и 88,9%, соответственно) для прогнозирования указанной мутации. Полученные нами данные согласуются с исследованием M.H. Chui et al., в котором чувствительность и специфичность данного метода оценки эозинофильных клеток составили 67 и 95%, соответственно [20].

Основное клиническое значение мутационного статуса BRAF и, следовательно, эозинофильных клеток заключается в прогностической ценности для наблюдения за пациентками с пограничными серозными опухолями. В проведенных ранее исследованиях статус мутации BRAF был успешно протестирован в качестве прогностического фактора [21, 22]. Кроме того, определение мутации KRAS также продемонстрировало прогностическую ценность, поскольку ее наличие в опухолях тесно связано с развитием рецидивов и повышенным риском трансформации в серозную карциному низкой степени злокачественности [9].

Для прогнозирования течения заболевания помимо анализа компонентов сигнального пути МАРК в настоящее время ведется поиск иммуногистохимических антител, которые можно было бы использовать в повседневной патологоанатомической практике. Обнаружено увеличение пролиферативной активности от доброкачественных серозных цистаденом до пограничных серозных опухолей и серозных карцином низкой степени злокачественности [23]. Однако окончательно установить пороговое значение для Ki67, которое обладало бы высокой чувствительностью и специфичностью для прогнозирования течения заболевания, не удалось [24, 25]. Несмотря на возможность иммуногистохимического анализа уровней экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, современные данные об их использовании для определения прогноза и течения заболевания также остаются неполными и противоречивыми. В то время как некоторые исследователи утверждают, что статус рецепторов стероидных половых гормонов может служить прогностическим фактором, другие не смогли подтвердить их прогностическую ценность, или же только один из маркеров продемонстрировал положительный прогностический потенциал [25–28]. Таким образом, пороговые значения для рецепторов эстрогена и прогестерона на данный момент окончательно не установлены.

Заключение

Показано, что эозинофильные клетки в серозных пограничных опухолях яичников могут в достаточной мере отражать мутацию BRAF, что позволяет выделить группы пациенток для проведения генетического тестирования. Таким образом, наличие взаимосвязи между гистологическими особенностями и определенными мутациями может лечь в основу будущей терапевтической стратификации, не требующей молекулярного профилирования опухоли. Прогностическая ценность рецепторов эстрогена и прогестерона при анализе безрецидивной выживаемости не обнаружена, однако индекс Ki67 более 7% был ассоциирован с повышенной вероятностью рецидива, что подчеркивает важность оценки пролиферативной активности для прогнозирования исходов заболевания.