Введение

Ревматическая болезнь сердца (РБС) – приобретенный порок сердца, развивающийся в результате аутоиммунной реакции на грамположительную бактерию Streptococcus pyogenes у генетически предрасположенного хозяина [1]. Несмотря на то, что в последние годы среди приобретенных пороков сердца преобладает дегенеративное поражение клапанов с кальцинозом, около 33 миллионов человек имеют установленный диагноз «ревматическая болезнь сердца». Следствием РБС чаще всего является поражение митрального клапана сердца, в 80% случаев представленное его стенозом [2, 3], поражение аортального и трикуспидального клапана также встречается в практике, но намного реже [4]. Хроническое асептическое воспаление, сопровождающее течение РБС, имеет большое значение в предрасположенности и прогрессировании данного патологического состояния [5]. Активация Т- и В-лимфоцитов антигенами β-гемолитического стрептококка инициирует выработку антител против эпитопа бактерии, которые взаимодействуют с эндотелиальными белками, что в свою очередь приводит к увеличению экспрессии молекул адгезии сосудистых клеток (VCAM-1) и молекул внутриклеточной адгезии (ICAM-1) [6]. Гиперэкспрессия VCAM-1 способствует инфильтрации эндотелия клапана сердца Т-клетками. Показано, что белки М, пептидогликаны и нуклеиновые кислоты, связанные с β-гемолитическим стрептококком группы А, способны стимулировать макрофаги экспрессировать такие провоспалительные цитокины как (IL)-1β и фактор некроза опухоли (TNF) [7], а сывороточные уровни IL-6 и TNF-α напрямую коррелируют с тяжестью порока клапана сердца [8]. Наряду с этим у пациентов с РБС отмечено преобладание Т-хелперов (CD4+) над цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8+) [9]. Кроме сывороточных уровней цитокинов, коррелирующих с прогрессированием РБС, продемонстрированы ассоциации с полиморфными вариантами генов, кодирующих цитокины. Так, проведенные нами исследования выявили ассоциации аллельных вариантов генов IL10 и IL12RB1, а также молекул врожденного иммунного ответа (TLRs) с повышенным риском развития РБС [10].

Неоваскуляризация может выступать неспецифическим воспалительным маркером в ряде патологических состояний, таких как инфекционный эндокардит, атеросклероз, сахарный диабет, некоторые виды онкологических заболеваний [11].

Важно отметить, что большинство исследований выполнено с использованием периферической крови пациентов с РБС и лишь небольшая часть из них посвящена изучению локальных воспалительных процессов непосредственно в тканях клапанного аппарата сердца. В связи с этим была сформулирована цель исследования, которая заключалась в изучении особенностей локальной экспрессии цитокинов и маркеров иммунных клеток в створках нативных митральных клапанов сердца со стенозом на фоне РБС.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили иссеченные во время кардиохирургического вмешательства створки нативных митральных и аортальных клапанов сердца пациентов с РБС (n=21), а также кальцинирующим аортальным стенозом (КАС) (n=19). Диагноз установлен на основании комплексного клинического и инструментального обследования пациентов. Исследование одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (протокол № 1 от 26.01.2016), добровольное информированное согласие подписывали все участники.

Полученный в ходе оперативного вмешательства биопсийный материал погружали в 0,9% раствор NaCl. Для выделения РНК фрагменты створок помещали в лизирующий реагент тризол (Invitrogen, США) с дальнейшей гомогенизацией образцов на приборе FastPrep-24 5G с лизирующим матриксом D (MP Biomedicals, США). Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли на флуориметре Qubit 4 (Invitrogen, США) с измерением индекса RIQ (RNA Integrity and Quality), используя набор реагентов Qubit RNA IQ Assay Kit (Invitrogen, США).

Уровень мРНК измеряли методом количественной полимеразной цепной реакции. Обратную транскрипцию осуществляли с помощью коммерческого набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Количественную полимеразную цепную реакцию с геноспецифическими праймерами (табл. 1) проводили на приборе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Относительный уровень экспрессии генов был нормирован на гены «домашнего хозяйства» (ACTB, GAPDH, B2M).

Для проведения иммуногистохимического анализа использовали фрагменты створок нативных клапанов сердца, зафиксированных в среде для замораживания тканей Neg-50 (6502, Thermo Fisher Scientific, США). Срезы толщиной 6 мкм подготавливали на микротоме HM525 NX (Thermo Fisher Scientific, США), после чего последовательно располагали на предметных стеклах с адгезивным покрытием. Для подготовки срезов использовали центральную часть створки клапана сердца от основания до свободного края с поражением. В качестве первичных антител для проведения анализа были использованы следующие маркеры: панлейкоцитарный маркер CD45 (ab10558, Abcam, 1:4000, Великобритания), маркер макрофагов CD68 (ab227458, Abcam, 1:1000, Великобритания), маркер Т-лимфоцитов CD3 (ab16669, Abcam, 1:1500, Великобритания), маркер B-лимфоцитов CD19 (MA5-32544, Invitrogen, 1:1500, США), миелопероксидаза нейтрофилов (ab208670, Abcam, 1:4000, Великобритания), маркер эндотелия сосудов CD31 (ab9498, Abcam, 1:500, Великобритания) применялся для оценки интенсивности неоваскуляризации. Для визуализации использовали коммерческий набор Novolink Polymer Detection Systems (Leica Biosystems, Германия) с докрашиванием гематоксилином. Исследуемые антитела разводили в 1% солевом растворе бычьего сывороточного альбумина. Окрашенные срезы заключали под покровное стекло с использованием монтирующей среды «Витрогель» (HM-VI-A250, «БиоВитрум», Россия). Сканирование осуществляли на автоматизированном лабораторном биологическом микроскопе MT5300L (Meiji Techno, США). Обработку гистологических слайдов и подготовку изображений проводили в программе QuPath v.0.4.1.

Статистический анализ полученных результатов выполняли в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова–Смирнова. Сравнение между двумя независимыми группами осуществляли с помощью U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты

Среди пациентов, включенных в исследование, в обоих группах наблюдалось преобладание женщин с медианой возраста 66 лет (60; 73) для пациентов с митральным стенозом и 68 лет (60; 71) для пациентов с КАС. Следует отметить, что обе группы не различались по основным клиническим характеристикам, однако среди пациентов с митральным стенозом наблюдался более высокий процент встречаемости фибрилляции предсердий (60%) по сравнению с пациентами с КАС (25%), но он не достигал статистической значимости (табл. 2).

Иммунофенотипирование продемонстрировало наличие воспалительных инфильтратов во всех изучаемых нативных створках митральных, а также аортальных клапанов, которые были представлены макрофагами (CD68+), клетками лейкоцитарного ряда (CD45+) и единичными Т-клетками (CD3+). Кроме того, кальцинированные аортальные клапаны характеризовались отсутствием нейтрофилов и В-лимфоцитов, в то время как в митральных клапанах наблюдалась более высокая инфильтрация MPO+ и CD19+ клетками. Следует отметить, что во всех створках в фиброзном слое отмечено наличие CD31+ клеток, а вместе с тем очагов интенсивной неоваскуляризации (рис.).

Анализ экспрессии генов, кодирующих основные провоспалительные и противоспалительные цитокины, а также некоторые хемокины, продемонстрировал гиперэкспрессию генов IL1B, IL6, IL8, TNFa, а также снижение уровня мРНК IL33, CCL4, CXCL1 в нативных клапанах сердца у пациентов с митральным стенозом на фоне РБС по сравнению с аортальными клапанами, пораженными КАС (табл. 3). Показано увеличение экспрессии гена PECAM1 в 8 раз и снижение экспрессии VCAM1 в митральных клапанах сердца по сравнению с аортальными.

Обсуждение

Ревматическая болезнь сердца – патологическое состояние, ассоциированное с поражением его клапанных структур и развивающееся вследствие аномальной аутоиммунной реакции на β-гемолитический стрептококк группы А (Streptococcus pyogenes) [12]. На поверхности β-гемолитического стрептококка группы А присутствуют три типа белковых антигенов: белки M, T и R. Белок М имеет наибольшее структурное сродство с некоторыми белками хозяина, например сердечным миозином, ламинином, виментином и тропомиозином [13]. Патофизиологические механизмы осложнений, которые развиваются после инфицирования гемолитическим стрептококком, остаются не до конца изученными, но стоит отметить, что одной из причин, запускающих аутоиммунную реакцию, может служить антигенная мимикрия между антигенами стрептококка и белками хозяина [14]. Аутореактивные антитела ответственны за активацию белков комплемента, развитие воспаления и последующее повреждение клапанов у генетически предрасположенных людей [9]. Продемонстрировано, что в очагах воспаления и активной неоваскуляризации с повышенной экспрессией фактора роста эндотелия сосудов происходит процесс минерализации клапана [15]. Иммуногистохимическое окрашивание, проведенное в нашем исследовании, показало очаги интенсивной неоваскуляризации (присутствие CD31+) в нативных митральных створках клапанов сердца со стенозом. Кроме того, также отмечена гиперэкспрессия гена PECAM1, кодирующего белок CD31, что может указывать на локальный воспалительный ответ, так как неоваскуляризация рассматривается как вероятный неспецифический маркер воспаления. Данные литературы свидетельствуют о том, что воспаление, а также гемодинамическое повреждение створок вносят свой вклад в прогрессирование РБС [16].

Важным звеном при инфицировании β-гемолитическим стрептококком группы А является запуск врожденного иммунного ответа (с участием дендритных клеток, нейтрофилов, а также макрофагов) [12]. Нейтрофилы способны разрушать бактерии посредством нейтрофильных ловушек, а также путем фагоцитоза и дегрануляции антимикробного пептида [17]. В проведенном нами исследовании отмечена более сильная инфильтрация MPO+ клетками, являющимися маркером нейтрофилов, створок митрального клапана, в то время как в аортальном клапане данные клетки отсутствовали. Наряду с этим еще одной отличительной чертой стенозированных митральных клапанов стало присутствие B-лимфоцитов (CD19+), при том, что в аортальных клапанах, пораженных КАС и инфекционным эндокардитом, они не детектировались [18]. По результатам оценки экспрессии генов в нативных клапанах сердца нами продемонстрировано увеличение уровня мРНК IL1B, IL6, IL8, TNFa, кодирующих основные противоспалительные цитокины, что свидетельствует о развитии локального воспаления. Согласно исследованиям, воспалительные инфильтраты в митральном клапане сердца при РБС у пациентов с терминальной стадией заболевания в основном представлены мононуклеарными клетками (Т-лимфоцитами (CD4, CD8), макрофагами и B-клетками) [9]. Эффекторная функция данных клеток и как следствие их вклад в патогенез РБС ассоциированы с профилем секретируемых цитокинов и других медиаторов, которые способствуют дифференцировке интерстициальных клеток в коллагенпродуцирующие миофибробласты [19]. Продемонстрировано, что лимфоциты вносят свой вклад в патогенез РБС посредством выработки антител на начальных этапах заболевания, однако некоторые исследователи предполагают, что они могут выполнять роль эффекторных клеток, которые участвуют в развитии хронического поражения [20]. Показана роль IL-1 в аутоиммунных заболеваниях, особенно при острой ревматической лихорадке [21]. В одном из популяционных исследований представлена ассоциация аллельных вариантов генов IL-1Ra и IL-6 с предрасположенностью к развитию РБС [22]. Инфильтрация тканей клапанов сердца макрофагами также имеет большое патогенетическое значение и принимает участие в развитие стеноза как митральных, так и аортальных клапанов сердца. Известно, что провоспалительные макрофаги (M1) способны проявлять свой эффекторный потенциал, активируя инфламмасому NLRP3 [23, 24], результатом чего является увеличение экспрессии IL-1β и IL-18, важных молекул, вовлеченных в патогенез ревматических заболеваний [25]. В нашем исследовании продемонстрировано увеличение экспрессии IL-1β в 3 раза, а для IL-18 уровень мРНК не изменялся в створках митральных клапанов, полученных от пациентов с РБС, по сравнению с аортальными клапанами. Показано, что IL-1β способствует высвобождению матриксных металлопротеиназ, рекрутингу и пролиферации резидентных фибробластов, а также секреции TGF-β и IL-6, вследствие чего может развиваться фиброз тканей [26].

Заключение

Проведенное исследование показало, что створки нативных митральных клапанов сердца со стенозом характеризуются локальным воспалительным ответом, очагами неоваскуляризации, а также агрессивной инфильтрацией нейтрофилами и B-лимфоцитами в противоположность аортальным клапанам с кальцинирующим аортальным стенозом.