Введение

Изучение почек в доклинических исследованиях имеет критически важное значение, так как этот орган является ключевым для мочевой системы и играет центральную роль в поддержании гомеостаза организма, включая регуляцию водно-электролитного баланса, кислотно-щелочного равновесия, а также выведения токсичных веществ [1–3].

При проведении доклинических исследований необходимость оценки состояния почек обусловливается следующим:

– почки имеют высокий уровень кровотока (20–25% сердечного выброса), что делает их уязвимыми к воздействию токсинов, лекарств и метаболитов;

– эпителий почечных канальцев активно участвует в реабсорбции и секреции веществ, что увеличивает риск его повреждения;

– многие препараты (например, антибиотики, противоопухолевые средства, нестероидные противовоспалительные препараты) могут вызывать повреждение почек;

– потенциальная нефротоксичность может быть выявлена на этапе доклинических исследований [4, 5].

Кроме того, исследования на животных (например, крысах, мышах) позволяют моделировать заболевания почек для оценки новых терапевтических методов, включая применение лекарственных препаратов. Этот подход позволяет изучать также механизмы старения почек и разрабатывать стратегии для замедления данных процессов, выявлять половые особенности при возрастных изменениях органа, что немаловажно для персонализированной медицины [6–8].

Существенным аспектом в проведении исследований является морфометрия почек, так как она позволяет количественно оценить структурные изменения в почках, выявить ранние признаки повреждения и проанализировать эффективность терапевтических вмешательств. Морфометрия обеспечивает объективность, воспроизводимость и комплексный подход к изучению состояния почек, что делает ее незаменимой для разработки новых лекарств и понимания механизмов заболеваний.

Применение морфометрии позволяет:

– точно измерить параметры, такие как толщина коркового и мозгового слоя, размер клубочков, площадь поверхности фильтрации, толщина базальной мембраны и объемная плотность различных структур;

– выявить ранние признаки повреждения почек, которые не всегда заметны при функциональных тестах (например, снижение скорости клубочковой фильтрации);

– количественно оценить степень повреждения почечных канальцев, клубочков и интерстиция, вызванного лекарственными препаратами или токсинами;

– сравнить степень повреждения между группами животных, получавших разные дозы препарата или подвергавшихся разным воздействиям;

– количественно оценить результаты терапии;

– количественно оценить возрастные изменения в почках;

– дополнить функциональные тесты, предоставляя полную картину состояния почек [9–13].

Наиболее распространенным модельным организмом является белая крыса, что обусловлено небольшой массой ее тела, относительной простотой содержания и разведения, непродолжительным периодом внутриутробного и постнатального развития, а также короткой продолжительностью жизни [14]. Весьма часто в исследованиях используют животных стока Вистар.

В настоящее время имеется много данных о функциональных различиях почек крыс Вистар и других линий (Спрег-Доули, Фишер 344, SHR и т.д.).

В частности, скорость клубочковой фильтрации у этих животных выше, чем у крыс Фишер 344, но ниже, чем у Спрег-Доули и SHR, а экскреция белка выше, чем у Спрег-Доули, но ниже, чем у SHR. Кроме того, крысы Вистар характеризуются низкой базальной экспрессией TGF-β1, умеренным уровнем антиоксидантных ферментов [14, 15], в то время как данные о морфологических особенностях почек крыс этой линии немногочисленны.

Представлялось актуальным изучение некоторых микроморфометрических показателей почек крыс Вистар обоих полов в различные периоды онтогенеза для получения референтных значений показателей структур органа.

Материалы и методы

Исследование проведено на базе лаборатории патологии клетки НИИ морфологии человека им. акад. А.П. Авцына «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского». Работа выполнена на 120 самцах и 120 самках крыс аутбредной линии Вистар в возрасте 3, 6 и 12 месяцев, разделенных на группы по 40 животных.

При проведении экспериментов руководствовались принципами гуманности, изложенными в директиве совета Европейского Союза (86/609/ЕЭС), а также в ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Исследование одобрено Комитетом по биоэтике НИИ морфологии человека им. акад. А.П. Авцына «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» (протокол № 11 от 22.12.2024).

Крысы получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России «Столбовая». Всех животных содержали в стандартных пластиковых клетках по пять особей в каждой, при естественном освещении, контролируемой температуре воздуха +20–22°С и относительной влажности воздуха 40–50%. Крысы имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120-1. Длительность периода адаптации к условиям вивария составила 20 суток. Выведение крыс из эксперимента осуществляли в интервале с 09.00 до 10.30 в углекислотной камере, оборудованной устройством для верхней подачи газа (100% СО2). Извлеченные органы осматривали макроскопически для выявления видимых патологических изменений (в случае обнаружения таковых животное отбраковывали), затем их взвешивали на весах CAS CAUX-220 (CAS Corporation, Южная Корея). Вычисляли относительную массу каждой почки. Фрагменты органов фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине с последующей стандартной проводкой по спиртам возрастающей концентрации (50°, 60°, 70°, 80° и 96°) и ксилолу. После проводки ткани заливали в гистологическую среду «Гистомикс» («БиоВитрум», Россия). Серийные гистологические срезы толщиной 5–6 мкм изготавливали на санном микротоме Leica SM2010 R (Leica Biosystems, Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Маллори по общепринятой методике. Микроскопическое исследование препаратов для обнаружения возможных патологических изменений выполняли на микроскопе Leica DM 2500 (Leica Biosystems, Германия). Анализировали оба парных органа.

Морфометрически определялись следующие параметры [10, 12, 16–20]:

– объемная плотность паренхимы, %;

– объемная плотность стромы, %;

– количество нефронов на 1 мм2, штук;

– диаметр почечных клубочков, мкм;

– диаметр проксимальных канальцев, мкм;

– высота эпителиоцита проксимальных канальцев, мкм;

– длина ядра эпителиоцита проксимальных канальцев, мкм;

– ширина ядра эпителиоцита проксимальных канальцев, мкм;

– площадь поперечного сечения ядра эпителиоцита проксимального канальца, мкм2;

– диаметр дистальных канальцев, мкм;

– высота эпителиоцита дистальных канальцев, мкм;

– длина ядра эпителиоцита дистальных канальцев, мкм;

– ширина ядра эпителиоцита дистальных канальцев, мкм;

– площадь поперечного сечения ядра эпителиоцита дистального канальца, мкм2.

Для получения репрезентативных данных анализировали не менее четырех срезов из разных частей почки. При микроморфометрии использовали программу ImageJ/Fiji (NIH, США) с соответствующими плагинами согласно методам, рекомендованным для анализа почек [10, 12, 17–20].

Для определения объемной плотности паренхимы и стромы использовался метод Делесса – классический стереологический подход, позволяющий оценить объемную плотность структур по их площади на случайных срезах ткани по формуле:

[21].

Cтатистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPadPrism v8.41 (GraphPad Software Inc., США). Тип распределения данных оценивали с помощью теста Д’Агостино–Пирсона. При нормальном распределении использовали t-тест Стьюдента для парного сравнения и тест Тьюки для сравнения трех и более групп. Различия между группами исследования оценивали с помощью теста Даннета. В случаях, когда распределение не соответствовало нормальному, использовали тест Манна–Уитни для парного сравнения и тест Данна для сравнения трех и более групп. Значимыми считали различия при уровне статистической значимости (α) или вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы ниже 5% (p<0,05).

Результаты

Проведенный анализ позволил установить, что абсолютная масса почек у самцов больше, чем у самок, во всех исследованных периодах онтогенеза. При этом масса органа у животных обоего пола возрастает к 6 месяцам, но снижается к 12. Относительная масса органа у самок больше, чем у самцов, и этот показатель в течение исследованного периода жизни также изменяется достоверно.

Исследование объемной плотности паренхимы и стромы в почках как у самцов, так и у самок изменяется разнонаправлено: доля паренхимы уменьшается, а доля стромы растет. Во всех исследованных периодах онтогенеза нами обнаружены межполовые различия.

Количество нефронов на единицу площади в течение онтогенеза снижается как у самцов, так и у самок (рис. 1), однако межполовые различия отмечаются только в 12 месяцев, когда плотность нефронов на единицу площади у самок превышает таковую у самцов.

Диаметр клубочков нефронов увеличивается в онтогенезе как у самцов, так и у самок, при этом у самцов крыс он остается более высоким во всех исследованных возрастных группах (рис. 2).

Морфометрия проксимальных канальцев показала, что с возрастом увеличиваются их диаметр, высота эпителиоцитов, ширина и длина их ядер, а также площадь их поперечного сечения как у самцов, так и у самок. При этом межполовые различия отмечаются для всех параметров, кроме ширины ядра.

Морфометрические параметры дистальных канальцев в исследованные периоды онтогенеза изменяются аналогичным образом, но при этом обнаруживаются достоверные межполовые различия (табл.).

Обсуждение

В результате проведенной работы установлено, что большинство изученных морфологических и микроморфометрических параметров претерпевает возрастные изменения. Для этих величин выявлены половые различия. Полученные данные совпадают с результатами ранее проведенных исследований [22–26].

Возрастные изменения в морфологии почек объясняются снижением уровня половых гормонов, влияющих на структуру и функцию этого органа, накоплением свободных радикалов, что приводит к повреждению нефронов, снижением регенеративной способности, ухудшением кровоснабжения почек из-за склерозирования сосудов и другими причинами [27, 28]. В свою очередь, половые различия определяются гормональным фоном животных: эстрогены оказывают нефропротективное действие, а андрогены влияют на рост соединительной ткани [29–31]. В частности, снижение объемной доли паренхимы и рост доли стромы вызваны потерей нефронов вследствие снижения регенераторных способностей органа, ишемии, возникающей из-за гемодинамических нарушений, интенсификации апоптоза и накопления коллагена [32].

Увеличение диаметра почечных клубочков в онтогенезе обусловлен компенсаторным укрупнением оставшихся нефронов при уменьшении их общего числа, накоплением фибрина и коллагена, а также гипертензией [33].

Увеличение размеров эпителиоцитов канальцев, по мнению ряда специалистов, является стандартной возрастной реакцией, обусловленной повышением функциональной нагрузки [34, 35]. Увеличение размеров ядер эпителиоцитов вызвано полиплоидизацией и ядерной фрагментацией в поздних периодах онтогенеза [36, 37].

Заключение

Проведенное исследование позволило установить конкретные значения ряда морфометрических параметров почек крыс Вистар обоего пола, обнаружить половые различия и выявить динамику изменения этих величин в исследованных возрастных группах. Полученные данные могут быть использованы в научной и практической деятельности, в частности при проведении доклинических исследований.