Введение

Нейтрофилы (нейтрофильные гранулоциты) – самые распространенные лейкоциты в крови, которые являются первой линией антиинфекционной защиты организма и повреждения тканей. Миграция нейтрофилов и ее роль во время воспаления оказались в центре повышенного интереса в последнее десятилетие [1]. Достижения в области визуализации в реальном времени и использование новых модельных систем помогли раскрыть поведение нейтрофилов в поврежденных и инфицированных тканях. Во время реакции на инфекцию или травму они быстро рекрутируются из кровотока, образуя очаги воспаления. Однако нейтрофилы из воспаленных тканей могут мигрировать также в ретроградном направлении через эндотелиальные клетки [2]. Эти клетки составляют популяцию тканевых нейтрофилов с отчетливым поверхностным фенотипом (ICAM-1^highCXCR1^low) и называются обратно-мигрировавшими нейтрофилами.

Нейтрофилы являются важным элементом врожденной иммунной системы, хотя в последнее время также признается их роль в качестве регуляторных и эффекторных клеток [3]. Установлено, что при определенных условиях они могут приобретать черты антигенпрезентирующих клеток, которые поглощают и представляют экзогенные антигены, стимулируя дифференцировку цитотоксических лимфоцитов посредством прямого взаимодействия между нейтрофилами и наивными CD8+ Т-клетками [4]. Будучи мощными эффекторными клетками, нейтрофилы уничтожают инфекционные патогены посредством фагоцитоза, дегрануляции, активных форм кислорода (АФК) и нейтрофильных внеклеточных ловушек [5–7].

Роль нейтрофилов как клеток врожденного иммунитета при тканевых повреждениях исследована давно, поэтому большое значение представляет понимание нейтрофильной миграции в контексте как острого, так и хронического воспаления при инфекционных заболеваниях [8]. По данным S. de Oliveira et al. [1], в процессе миграции нейтрофилов при остром повреждении тканей различают три основные фазы: ранняя фаза рекрутирования, индуцированная кратковременными сигналами, фаза амплификации инфильтрации в ответ на стойкие вредные сигналы и фаза разрешения воспаления, которая может включать обратную миграцию нейтрофилов.

Прямая миграция нейтрофилов

Нейтрофилы образуются в костном мозге из стволовых клеток, которые делятся и дифференцируются в зрелые нейтрофилы, полностью оснащенные гранулярным арсеналом [7]. В системном кровотоке они циркулируют как спящие клетки. Прямая миграция представляет собой процесс поступательного проникновения нейтрофилов к месту повреждения и/или инфекции в процессе их экстравазации из сосудистой сети в ткани [9, 10]. Попав в очаги инфекции, нейтрофилы убивают микроорганизмы микробицидными агентами, высвобождаемыми из гранул. В этой фазе задействованы некоторые сигналы, включая молекулярные структуры, связанные с повреждением, пероксид водорода, липидные медиаторы и хемокины. В результате прямой миграции лейкоцитов формируются воспалительные очаги в органах и тканях.

На современном этапе развития клеточной биологии раскрыта сложность защитной системы хозяина, в частности клеток врожденного иммунитета. Например, моноциты (или мононуклеарные фагоциты), играющие важную роль в защите от патогенов и заживлении ран, общепризнанно являются морфологически, фенотипически и функционально гетерогенными [11]. Однако нейтрофилы долгое время считались относительно однородной популяцией клеток, поскольку традиционно их представляли короткоживущими клетками-«камикадзе», которые быстро прибывают в места инфекции и травмы, проявляют чрезмерную активность и погибают в инфильтрированной ткани.

Нейтрофилы экспрессируют более 30 разных рецепторов клеточной поверхности для распознавания инвазии патогенов и воспалительного окружения, включая рецепторы, связанные с G-белком, Fc-рецепторы, рецепторы адгезии, цитокиновые рецепторы и рецепторы распознавания образов, которые могут модулировать миграцию, функцию и поведение нейтрофилов [12]. Сигнальные пути этих рецепторов могут также влиять на транскрипционную активность нейтрофилов, фагоцитоз, апоптоз, дегрануляцию и продукцию АФК [13]. Как только нейтрофилы преодолевают многочисленные слои сосудистой стенки и попадают во внесосудистое пространство, они приобретают оптимизированный фенотип, имеющий способность к обнаружению поврежденных тканей и микробной очистке [14, 15].

Обратная миграция нейтрофилов

Считается, что для успешного разрешения воспаления необходимо удаление нейтрофилов из места повреждения, и этот клиренс нейтрофилов может происходить посредством их апоптоза или некроза и последующего фагоцитоза макрофагами [1, 16]. Исследования нейтрофилов мышей [17] и человека [18, 19], показали, что нейтрофилы могут покидать участки повреждения тканей в ходе процесса, называемого обратной миграцией (ОМ). С развитием методов визуализации в 2006 году впервые появилось сообщение о миграции нейтрофилов из очага воспаления обратно в сосудистую систему. На основании полученных данных сформулирована концепция обратной миграции, предполагающая, что этот феномен также является важным путем очистки тканей от активированных нейтрофилов [20]. Пути миграции при воспалении показаны на рисунке.

В 2017 году J. Wang et al. [21] изучили поведение нейтрофилов при стерильном повреждении и репарации, подтвердив, что процесс ОМ происходит в две фазы: первая фаза – возвращение нейтрофилов из очага воспаления в кровеносное русло, вторая фаза – ОМ нейтрофилов из кровеносных сосудов снова в костный мозг для стимулирования апоптоза [2, 21]. При этом феномен возвращения нейтрофилов из очага воспаления в просвет сосудов также стал известен как обратная трансэндотелиальная миграция (ОТМ или rTEM).

Установлено, что после рекрутирования большинство нейтрофилов из сайтов повреждения возвращается в сосудистую систему. Количество нейтрофилов в месте повреждения достигает максимума через 12 часов после воздействия повреждающего фактора, через 24 часа их число уменьшается более чем на 90%, а через 48 часов они почти полностью исчезают, и только около 10% нейтрофилов подвергается апоптозу [21]. Усиление синтеза CXCR4 в нейтрофилах позволяет им возвращаться в костный мозг через CXCL12, и этот феномен предполагает, что нейтрофилы сначала перемещаются в легкие, а затем избирательно мигрируют в костный мозг посредством CXCR4 [21, 22].

Представляет интерес, каковы фенотип и судьба обратно- мигрировавших нейтрофилов. Установлено, что по сравнению с клетками в тканях и кровотоке нейтрофилы, подвергающиеся ОМ, приобретают уникальные фенотипы на основе определенных молекулярных маркеров [23], которые характеризуются высоким уровнем молекул клеточной адгезии-1 (ICAM-1 или CD54), низким уровнем CXCR1, в то время как у нейтрофилов в резидентной ткани отмечен низкий уровень ICAM-1 и CXCR1, а для циркулирующих нейтрофилов характерен низкий уровень ICAM-1 но высокий уровень CXCR1 [23]. Это свидетельствует о том, что нейтрофилы в организме имеют несколько фенотипов, что отражает разные функции данного типа лейкоцитов.

Влияние обратной миграции нейтрофилов на макроорганизм

Полагают, что ОМ регулирует стадию воспаления, уменьшает задержку нейтрофилов в очаге воспаления и ускоряет разрешение локального воспаления [20], однако некоторые исследователи обнаружили, что ОМ способна приводить к перераспределению активированных нейтрофилов в другие органы и вызывать генерализацию системного воспаления [24, 25]. Феномен ОМ указывает на то, что нейтрофилы обладают множественными функциями, а точный контроль этого процесса может быть важной терапевтической стратегией, способствующей разрешению воспаления.

C.D. Buckley et al. [23] установили, что обратная трансмиграция нейтрофилов человека происходит через монослой эндотелия in vitro, идентифицировав маркеры, характерные для обратно-мигрировавших нейтрофилов (ICAM-1^highCXCR1^low), и выявили этот фенотип клеток в периферической крови пациентов с системным воспалением. В совокупности исследования этих авторов показали, что ОМ является потенциальной новой мишенью для лекарственной терапии заболеваний, характеризующихся чрезмерной нейтрофильной инфильтрацией.

Потенциальные механизмы обратной миграции нейтрофилов

Сигналы, которые опосредуют ОМ нейтрофилов из мест повреждения тканей, остаются в значительной степени неизвестными. Было предложено несколько механизмов для объяснения ОМ из воспаленных тканей, включая конкуренцию между источниками хемоаттрактантов в ране и сосудистой сети, а также снижение уровня раневых хемоаттрактантов и/или внутренние транскрипционные изменения нейтрофилов [26]. Вполне вероятно, что такой сложный процесс как ОМ нейтрофилов происходит за счет комбинации этих механизмов.

При поиске ответа на вопрос, от чего зависит, мигрируют ли нейтрофилы обратно в кровоток или погибают в месте повреждения, установлено, что их разные субпопуляции могут быть предрасположены к ОМ с момента выхода из кровообращения или из-за транскрипционных изменений, индуцированных в месте повреждения [27, 28]. На основании опытов in vitro высказано предположение [18, 19], что нейтрофилы с меньшей вероятностью будут обратно мигрировать из мест инфекции, чтобы предотвратить распространение внутриклеточных патогенов.

Установлено, что нейтрофилы, подвергшиеся ОТМ in vitro, экспрессируют специфические маркеры: ICAM-1^high и CXCR1^low. Эти маркеры использовались для идентификации нейтрофилов, предположительно подвергшихся ОТМ, в периферической крови человека [23] и во вторичных очагах воспаления у мышей [29]. Важно отметить, что нейтрофилы человека и мыши, подвергшиеся ОТМ in vitro и in vivo, продуцируют более высокие уровни АФК [23, 29]. Хорошо известно, что активированные нейтрофилы склонны продуцировать АФК, избыток которых может привести к повреждению тканей или органов. После ОМ со сдвигом фенотипа в сторону провоспалительного состояния нейтрофилы продуцируют большое количество АФК [23, 29]. Эти клетки накапливаются в легких или других органах, что может легко вызвать повреждение тканей и быть одной из причин распространения системного воспаления из-за ОМ.

Пытаясь выяснить, является ОМ хорошим или плохим исходом воспаления, S. de Oliveira et al. показали [1], что хотя чрезмерная и длительная нейтрофильная инфильтрация может привести к развитию хронического воспаления тканей, миграция нейтрофилов обратно в кровоток способна вызвать системное воспаление и повреждение тканей дистальных органов. В случае повреждения тканей обратная миграция имеет положительные эффекты в локальном очаге воспаления, поскольку истощение нейтрофилов улучшает заживление ран, но может вызывать системные негативные последствия, такие как полиорганная недостаточность [30]. Следовательно, необходимы четкие доказательства того, что обратно-мигрировавшие нейтрофилы обладают про- или противовоспалительным фенотипом. Диссеминированные нейтрофилы, демонстрирующие сильный провоспалительный или противовоспалительный фенотип, могут иметь вредные эффекты, такие как содействие повреждению органных тканей или системной иммуносупрессии, соответственно.

Гетерогенность нейтрофилов у здоровых и болеющих людей

Нейтрофилы традиционно считаются короткоживущими терминально дифференцированными клетками врожденного иммунитета, фундаментальная роль которых заключается в антимикробной защите с широким спектром функций [31]. Потенциальное существование отдельных подмножеств (субпопуляций) нейтрофилов с функциональной и фенотипической гетерогенностью долгое время широко не исследовалось. В последнее десятилетие на разных моделях получены доказательства существования различных субпопуляций нейтрофилов как в физиологических, так и в патологических условиях [28, 32–35]. Исследование нейтрофильной гетерогенности начались еще в 1970–1980-х годах, но проблема до сих пор остается актуальной. В связи с этим в настоящее время важным становится изучение разнообразия нейтрофильных фенотипов и их характеристик [36, 37].

Около 50–70% всех лейкоцитов периферической крови составляют циркулирующий гранулоцитарный пул [38]. Апоптоз лейкоцитов является основной формой естественной гибели нейтрофилов, которая, как известно [39, 40], протекает без воспаления.

По классификации М.П. Потапнева и соавторов (2019), с учетом этапов созревания в костном мозге, распределения в периферической крови, органах и тканях макроорганизма, выделяются различные фенотипические субпопуляции нейтрофилов [37]: незрелые (в костном мозге в норме, в периферической крови при патологических состояниях), зрелые (в периферической крови в норме и при патологических состояниях), зрелые активированные (в периферической крови при воспалительных процессах), стареющие (обычно в тканях, где нейтрофилы подвергаются удалению тканевыми макрофагами путем эффероцитоза).

В последние 20 лет установлена длительная продолжительность жизни нейтрофилов в периферической крови (вплоть до 90 часов и более), что может заложить основу для фенотипических и функциональных изменений этих клеток и объяснить гетерогенность нейтрофилов [22, 41]. При этом уже высказывалось предположение, что нейтрофилы способны переключаться с классического фенотипа на долгоживущий в зависимости от условий внутренней среды организма [42]. Выявлено, что нейтрофилы старых мышей («стареющая» подгруппа) имеют гиперсегментированное ядро и уменьшенный размер [43, 44]. Показано [43–46], что субпопуляция стареющих нейтрофилов имеет фенотип CD62L^lowCXCR4^highCD11B^highCD49^high, а подтип N1 нейтрофилов c антинеопластической активностью – CD11b⁺/Ly6G⁺ (в отличие от иммуносупрессорных нейтрофилов) [47, 48]. Маркерами иммунофенотипа зрелых активированных при воспалении нейтрофилов являются CD15+CD11b^high CD16^high CD62L^low CD11c+ СD10+CD66b^high CXCR2^low CXCR4^high [41]. Как отметили М.П. Потапнев и соавт. [37], фенотипические характеристики субпопуляций нейтрофилов не отражают напрямую их функцию. Установлено, что субпопуляционный состав нейтрофилов зависит от стадии и активности воспаления, имеет прогностическое значение и может учитываться при терапевтическом воздействии у пациентов [45].

В периферической крови циркулируют нейтрофилы с тремя или четырьмя сегментами ядра. Для нейтрофилов, покидающих кровеносное русло, характерно большее (четыре–пять) количество сегментов ядра, ассоциированное с высокой экспрессией молекул адгезии LFA-1, LFA-3, PECAM-1 [49].

Большинство нейтрофилов периферической крови в норме относится к популяции высокой плотности, тогда как при патологических состояниях (в том числе при воспалении) часть лейкоцитов периферической крови выделяется как нейтрофилы низкой плотности, имеющие преимущественно незрелый тип морфологии (палочкоядерные клетки или миелоциты) [50, 51]. Это характерная субпопуляция провоспалительных нейтрофилов, идентифицированная как клетки фенотипа CD15+/CD14^low, CD10+/CD14^low, CD16^high/CD86. Такие нейтрофилы высвобождают повышенное количество интерферонов типа I и IFN-γ, а также TNF-α, однако они демонстрируют снижение фагоцитарной активности, для выяснения причины которого необходимы дальнейшие исследования. При септических состояниях в крови увеличивается содержание нейтрофилов низкой плотности с иммуносупрессорными характеристиками (G-MDSCs), что свидетельствует о тяжести заболевания [52, 53]. Популяция нейтрофилов низкой плотности в основном связана с аутоиммунными патологиями [53–55], сепсисом и синдромом системного воспалительного ответа [56]. Существуют также незрелые нейтрофилы костного мозга, характеризующиеся как клетки CD10^low/–CD16^low и выявляемые при тяжелых системных инфекциях [57]. У пациентов с воспалением обнаружены зрелые нейтрофилы с оболочкой из антител CD11cb^right/CD62L^dim/CD11b^bright/CD16^bright, уникальная циркулирующая популяция миелоидных клеток, способная подавлять пролиферацию Т-клеток человека [58].

Таким образом, нейтрофилы долго рассматривались только как гомогенная популяция клеток, фагоцитирующих микроорганизмы и обеспечивающих врожденный противоинфекционный иммунитет. В настоящее время функции и субпопуляционный состав нейтрофилов характеризуются большим разнообразием, то есть гетерогенностью. При патологических состояниях нейтрофилы не только мигрируют в очаг поражения/воспаления и погибают там, но частично подвергаются ОМ в кровоток либо распространяются в другие органы и ткани, включая костный мозг.

Хотя до сих пор многие вопросы остаются без ответа, однозначно определено, что миграция нейтрофилов играет решающую роль в воспалительной патологии. В последнее время были разработаны модели и технологии, которые позволяют дополнительно выяснить сигналы прямой миграции и значение ОМ в патогенезе инфекционных заболеваний. Установлено, что молекула соединительной адгезии-С (JAM-C) имеет ключевое значение в стимулировании ОТМ нейтрофилов, которая способствует распространению системного воспаления и вторичному повреждению органов [24, 25]. Из очага воспаления нейтрофилы могут успешно прорываться через эндотелиальные клетки и возвращаться в кровоток вследствие наличия в сосудистой стенке специального канала, «переключателем» которого является JAM-C, регулирующая ОМ [29]. Разрушение JAM-C на эндотелиальных клетках или нокдаун гена JAM-C значительно увеличивают вероятность ОМ нейтрофилов, которая в основном достигается парацеллюлярным путем [29]. Установлено, что нейтрофилам, которые мигрируют обратно в кровоток, трудно снова рекрутироваться в очаг воспаления [23], это указывает на то, что канал обратной миграции, связанный с JAM-C, является однонаправленным.

Основной интегрин b2 опосредует перемещение нейтрофилов вдоль эндотелиальных клеток к точкам парацеллюлярной (между эндотелиоцитами) и трансцеллюлярной (через эндотелиоциты) миграции [59]. ICAM-2, сконцентрированный в эндотелиальных клеточных соединениях, далее направляет нейтрофилы к проникновению в эндотелиальные клетки [60]. Считается, что трансцеллюлярный путь используют около 20% нейтрофилов, но он может сильно различаться в разных тканях и зависеть от стимуляции эндотелиальных клеток в условиях in vitro [59].

Заключение

В течение последнего десятилетия получены доказательства формирования различных фенотипов нейтрофилов как в физиологических, так и в патологических условиях, что имеет тесную связь с их миграционной способностью. Однако несмотря на многолетние исследования, проблема нейтрофильной гетерогенности до сих пор остается актуальной, поэтому требуется дальнейшее углубленное изучение разнообразия нейтрофильных фенотипов и их функциональных характеристик. Точный контроль обратной миграции нейтрофилов может быть важной терапевтической стратегией, способствующей разрешению воспаления.