Введение

В настоящее время рак пищевода находится на восьмом месте по частоте заболеваемости и на шестом месте среди причин смерти от онкологии [1]. По данным проекта «Глобальная заболеваемость раком, смертность и распространенность», в 2020 году стандартизованная по возрасту заболеваемость раком пищевода составила 6,3 на 100 000 человек, а смертность от рака пищевода – 5,6 на 100 000 человек [2]. Плоскоклеточный рак пищевода составляет около 85% всех диагностированных случаев, вторым гистологическим типом по встречаемости (14%) является аденокарцинома пищевода, в ряде европейских стран выходящая на первое место по частоте заболеваемости. Рак пищевода часто диагностируют на поздних стадиях заболевания (по данным Surveillance, Epidemiology, and End Results, SEER), в 32% вновь диагностированных случаев рака пищевода определяются метастазы в регионарных лимфатических узлах и в 38% отдаленные метастазы [3]), что определяет плохой прогноз онкологического заболевания. 5-летняя выживаемость у пациентов с раком пищевода составляет лишь 21,6%.

Плоскоклеточный рак и аденокарцинома пищевода отличаются по молекулярно-биологическим и генетическим параметрам. К общим факторам риска возникновения относятся мужской пол, курение, ахалазия, низкий уровень употребления овощей и фруктов, избыточное поступление с пищей нитрозаминосоединений [4–6]. К факторам риска развития плоскоклеточного рака пищевода также относят употребление алкоголя и низкий социально-экономический статус. В свою очередь, аденокарцинома развивается у пациентов с пищеводом Барретта на фоне длительно существующей гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и часто связана с ожирением [7–10].

Несмотря на разные клеточные источники развития плоскоклеточного рака и аденокарциномы пищевода (дисплазия многослойного плоского эпителия и дисплазия при пищеводе Барретта), общность в их канцерогенезе представляют нарушения гена TP53 [11]. Так, мутации TP53 обнаружены в 91% случаев плоскоклеточного рака и 69–72% случаев аденокарциномы пищевода [12–14]. Мутации гена TP53, по-видимому, являются инициирующими событиями канцерогенеза, так как они широко представлены при пренеопластических изменениях как многослойного плоского эпителия, так и при пищеводе Барретта (даже без дисплазии) у пациентов, у которых в дальнейшем развилась тяжелая дисплазия и аденокарцинома пищевода [11, 13, 15]. Во многих исследованиях убедительно показана связь нарушенной экспрессии p53 с наличием дисплазии и ее прогрессированием до аденокарциномы при пищеводе Барретта [16, 17]. Повышенный уровень иммуногистохимической реакции на p53 ассоциирован с более плохим прогнозом и низкой выживаемостью у пациентов с плоскоклеточным раком пищевода [18–20]. В свою очередь, при аденокарциноме пищевода аберрантная иммуногистохимическая реакция на p53 ассоциирована с более низкой общей и безрецидивной выживаемостью [21], но также и с хорошим ответом на неоадъювантную химиотерапию [22].

Инактивация гена-регулятора клеточного цикла CDKN2A путем мутации, делеции или эпигенетического сайленсинга выявлена в 76% случаев рака пищевода (включая и плоскоклеточные карциномы, и аденокарциномы пищевода) [12]. Отмечено усиление реакции на p16/Rb в ряду неизмененный многослойный плоский эпителий–эзофагит–дисплазия/карцинома in situ многослойного плоского эпителия–плоскоклеточный рак пищевода [23]. Также выявлена аберрантная реакция на p16 при пищеводе Барретта [24]. Показано, что повышенная реакция на p16 в плоскоклеточном раке пищевода связана с более высокой общей и безрецидивной выживаемостью, чаще наблюдается на I–II стадиях заболевания и более характерна для высоко- и умереннодифференцированных опухолей [25]. Высокий индекс Ki67 и отсутствие экспрессии p16 определяются у пациентов с более низкой выживаемостью [26]. Таким образом, иммуногистохимическое исследование с маркерами p53, p16 и Ki67 дает важную информацию о степени агрессивности поведения обоих наиболее частых гистологических типов рака пищевода.

Целью нашего исследования было оценить иммуногистохимический профиль маркеров, определяющих дифференцировку и биологическое поведение плоскоклеточного рака и аденокарциномы пищевода.

Материалы и методы

Исследование одобрено локальным этическим комитетом РНЦХ им. акад. В.Б. Петровского (протокол № 8 от 20.10.2022). В исследование вошли 100 пациентов с морфологически подтвержденным раком пищевода. Для верификации диагноза пациентам выполнялась эзофагогастродуоденоскопия с биопсией. Биопсированные фрагменты фиксировали в 10% забуференном формалине. Материал проходил рутинную проводку, заливку в парафиновые блоки, микротомию с толщиной срезов 3 мкм. Проводилось окрашивание гистологических срезов гематоксилином и эозином, а также реактивом Шиффа в сочетании с альциановым синим по стандартной методике. Выполнялась иммуногистохимическая реакция с маркерами p53 (D0-7, Leica Biosystems Newcastle, Великобритания), p16 (E6H4, Roche/Ventana, США), Ki67 (MМ-1, Leica Biosystems Newcastle, Великобритания), CK5/6 (XM26, Leica Biosystems Newcastle, Великобритания), p63 (4А4, Roche/Ventana, США), MUC5AC (MRQ-19, Cell Marque, США), MUC6 (MRQ-20, Cell Marque, США), MUC2 (MRQ-18, Cell Marque, США). Уровень выраженности реакции на p53 оценивался по шкале IRS (immunoreactivity scale, иммунореактивная шкала), где IRS = A × B, что включает анализ количества иммунопозитивных клеток (A, ≤10% – 1 балл, 11–49% – 2 балла, 50–79% – 3 балла, ≥80% – 4 балла) и степень интенсивности ядерного окрашивания (B, негативное окрашивание – 0, слабое окрашивание – 1, окрашивание умеренной интенсивности – 2, интенсивное окрашивание – 3) [18]. Низкий уровень выраженности реакции на p53 определялся при IRS≤6, а высокий – при IRS>6. Уровень выраженности реакции на Ki67 (индекс пролиферации) оценивался как низкий при положительной реакции в <30% опухолевых клеток и как высокий при уровне положительной реакции в ≥30% опухолевых клеток. Уровень выраженности реакции на p16 оценивался и в ядре, и в цитоплазме опухолевой клетки. Повышенный уровень p16 отмечался при положительной реакции в ≥70% опухолевых клеток, очаговая реакция – при положительном окрашивании <70% опухолевых клеток, негативным считалось полное отсутствие реакции на p16 в опухолевых клетках. Положительной реакция на CK5/6, p63, MUC5AC, MUC6 и MUC2 считалась при относительном числе окрашенных клеток >1%. Статистическая обработка проводилась с использованием критерия Фишера. Различия считались статистически значимыми при уровне p<0,05.

Результаты

В исследование вошли 100 пациентов с раком пищевода в возрасте от 40 до 93 лет. Медиана возраста соответствовала 71,5 года [64,75–79 лет]. Соотношение мужчин и женщин составило 67 к 33 (2:1). У 40 пациентов диагностирован плоскоклеточный рак, у 53 – аденокарцинома пищевода, у семи – анапластический рак. В группе с плоскоклеточным раком и аденокарциномой пищевода относительное число пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли значимо не отличалось (p>0,05, табл. 1).

Иммуногистохимическое исследование выполнено для 74 пациентов: 50 с аденокарциномой пищевода и 24 с плоскоклеточным раком пищевода (рис. 1). У всех пациентов с плоскоклеточным раком выявлена позитивная реакция к маркерам плоскоклеточной дифференцировки (CK5/6 и p63), реакция на муцины (MUC5AC, MUC6 и MUC2) была негативной. У пациентов с аденокарциномой пищевода отмечалась негативная реакция на CK5/6 и p63, а реакция на муцины распределялась следующим образом: на MUC5AC выявлена у 78% пациентов, на MUC6 – у 52% пациентов и на MUC2 у 38% пациентов, негативная реакция на муцины отмечена у 10% пациентов. Высокий уровень реакции на p53 (рис. 2) выявлен у 11 пациентов с плоскоклеточным раком пищевода (45,83%) и у 25 пациентов с аденокарциномой пищевода (50%) (различия статистически незначимые, p>0,05). Повышенный уровень реакции на p16 (рис. 3) отмечен у 27 пациентов с аденокарциномой пищевода (54%) и лишь у двух пациентов с плоскоклеточным раком пищевода (8,33%), полное отсутствие реакции на p16 не выявлено ни у одного из пациентов. В обоих типах рака пищевода повышенный уровень реакции на p16 несколько чаще встречался у пациентов с низким уровнем реакции на p53 (табл. 2), однако различия статистически незначимы. Уровень выраженности реакции на Ki67 в опухолях варьировал от 18 до 95%. Выраженная реакция на Ki67 (рис. 4) чаще наблюдался при высоком уровне реакции на p53 в обоих гистологических типах рака пищевода (p<0,01, табл. 3).

Обсуждение

Высокий уровень выраженности реакции на p53 выявлен нами в 45,83% случаев плоскоклеточного рака пищевода и 50% наблюдений аденокарциномы, что подтверждает важную роль белка p53 и гена TP53 в канцерогенезе разных гистологических типов рака пищевода. Так, известно, что мутации гена TP53 являются инициирующим событием пренеопластической трансформации при пищеводе Барретта и могут выявляться у прогрессоров раньше, чем морфологическая картина дисплазии низкой степени в метаплазированном сегменте [13, 15]. Мутации гена TP53 также представляют собой наиболее частое генетическое событие при дисплазии многослойного плоского эпителия и плоскоклеточном раке пищевода [11]. Потеря контроля над репарацией ДНК и апоптозом в результате нарушения функции и проявление различных проонкогенных эффектов мутантного белка p53 [27] значительно ускоряют злокачественную трансформацию и онкогенез в пищеводе. Вместе с тем высокий уровень реакции на p53 связан с более низкой выживаемостью при плоскоклеточном раке и аденокарциноме пищевода [18, 19, 21].

Мутации гена CDKNA также довольно распространены как при плоскоклеточном раке, так и при аденокарциноме пищевода [12]. Повышенная реакция на продукт этого гена p16 связана с более низкой стадией плоскоклеточной карциномы и более высокой выживаемостью [25]. При этом в отличие от плоскоклеточного рака шейки матки, а также головы и шеи связь между экспрессией p16 и выявлением вируса папилломы человека в плоскоклеточной карциноме пищевода убедительно не показана [28]. Согласно другим работам, вирус папилломы человека может играть роль в развитии плоскоклеточной карциномы пищевода [29]. В то же время есть данные, которые отрицают связь выявления данной инфекции и повышенной реакции на p53 и p16 с прогнозом плоскоклеточного рака пищевода [28, 30].

В нашем исследовании повышенная реакция на p16 преобладала при аденокарциноме пищевода и тенденциозно выявлялась чаще при низком уровне выраженности реакции на p53 в обоих гистологических типах рака пищевода. Полная потеря реакции на p16 нами не обнаружена. По данным литературы, потеря реакции на p16 и высокий индекс пролиферации связаны с плохим прогнозом обоих гистологический типов рака пищевода [26]. Высокий индекс пролиферации в нашем исследовании был связан с высоким уровнем выраженности на p53. Таким образом, иммуногистохимическое исследование с маркерами p53, p16 и Ki67 имеет прогностическую ценность при обоих наиболее частых гистологических типах рака пищевода. При этом требуется проведение дальнейших, в том числе проспективных, исследований для более глубокого изучения прогностических факторов при раке пищевода.

Заключение

Определение экспрессии иммуногистохимических маркеров p53, p16 и Ki67 в аденокарциноме и плоскоклеточном раке пищевода представляет ценность для установления прогноза заболевания.