доктор медицинских наук, доцент; профессор кафедры патологической анатомии и судебной медицины имени профессора В.Л. Коваленко (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор медицинских наук, профессор; профессор кафедры акушерства и гинекологии (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
кандидат медицинских наук; доцент кафедры акушерства и гинекологии (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
доктор медицинских наук, профессор; заведующий кафедрой патологической анатомии и судебной медицины имени профессора В.Л. Коваленко (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
аспирантка кафедры патологической анатомии и судебной медицины имени профессора В.Л. Коваленко (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
кандидат педагогических наук; доцент кафедры математики, медицинской информатики, информатики и статистики, физики (ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Плацента – важный орган, обеспечивающий взаимосвязь между организмом матери и плода, а также защиту плода от влияния вредных факторов, в том числе инфекций [1]. Плацентарная недостаточность влияет не только на перинатальные исходы, но и на формирование хронической патологии различных органов и систем [2].
Сегодня хорошо изучены морфологические изменения в плацентах женщин в период острой COVID-19. Описано формирование материнской и фетальной мальперфузии, тромбогеморрагических и воспалительных изменений в плаценте на фоне активной инфекции [3–5]. Сообщается о развитии плацентита SARS-CoV-2, ассоциированного с перинатальными потерями на фоне острой COVID-19 [6, 7].
Вместе с тем данные о структурных особенностях плацент пациенток в период реконвалесценции противоречивы. Некоторые авторы сообщают, что у реконвалесцентов (РК) после COVID-19, перенесенной в разные сроки гестации, наблюдаются значительные плацентарные повреждения, проявляющиеся выраженными признаками материнской и фетальной мальперфузии [8, 9]. Y.P. Wong et al. [10] в результате анализа гистологических особенностей плацент у женщин с острой COVID-19, манифестировавшей во II/III триместре (n=33), и РК (n=14, интервал от манифестации COVID-19 до родов 106,43±53,18 дня) выявили, что инфаркты ворсин наблюдаются в 2,4 раза чаще в плацентах РК без статистически значимой разницы. Фетальная мальперфузия в виде аваскулярных ворсин, тромбоза сосудов плода обнаруживается в единичных случаях в обеих группах, а хорангиоз – в 1,8 раза чаще в плацентах РК без статистически значимого преобладания. Сообщается о высокой частоте гистиоцитарного интервиллузита, децидуита и виллузита в плацентах пациенток после COVID-19 [8–10].
B. Bayraz et al. [11] исследовали 67 плацент после преждевременных и своевременных родов (34,0–41,5 недели; 39,0±1,1 недели) у РК после COVID-19 (более 14 дней после положительного теста на SARS-CoV-2) в сравнении с плацентами женщин без COVID-19 (n=126). Представлены данные о статистически значимом преобладании материнской (р<0,001) и тенденции к преобладанию фетальной (р=0,051) мальперфузии. Статистических различий по воспалительным (р=0,849) и тромботическим (р=0,248) плацентарным повреждениям между группами не выявлено.
A. Dagelic et al. [12] изучали плацентарные повреждения у РК, получавших и не получавших низкомолекулярные гепарины (НМГ) в период острой COVID-19. У получавших НМГ не было выявлено статистически значимых отличий по частоте регистрации признаков материнской мальперфузии, характеру воспалительных изменений в сравнении с неполучавшими НМГ независимо от триместра манифестации инфекции. В то же время фетальная мальперфузия регистрировалась статистически значимо чаще у РК после COVID-19, перенесенной во II триместре (р=0,020), и у женщин, не получавших НМГ (р=0,017).
Таким образом, полагаем, что в связи с неоднородностью имеющихся на сегодняшний день данных целесообразно дальнейшее изучение характера плацентарных повреждений у РК после COVID-19.
Цель исследования – оценить морфологические особенности плацент при доношенной беременности у реконвалесцентов, перенесших COVID-19 в разные триместры гестации.
Выполнено ретроспективное когортное исследование. Проанализированы особенности акушерско-гинекологического анамнеза, соматической патологии, течения беременности и родов, перинатальных исходов, гистологические изменения в плацентах 110 пациенток, родивших на доношенном сроке гестации.
Группу I составили 80 РК после COVID-19, перенесенной в разных триместрах беременности: 1-я подгруппа – 20 женщин, перенесших COVID-19 в I триместре, 2-я подгруппа – 30 пациенток, перенесших COVID-19 во II триместре, 3-я подгруппа – 30 РК, перенесших COVID-19 в III триместре гестации. Пациентки группы I с апреля 2020 по декабрь 2021 года поступали на лечение с острой COVID-19 в COVID-госпиталь Челябинска.
Группа II – 30 женщин, не болевших COVID-19 во время текущей беременности, родивших на доношенном сроке гестации в родильном доме областной клинической больницы № 3 Челябинска с июля 2020 по февраль 2021 года.
Далее проводили углубленное морфологическое исследование плацент с оценкой уровня экспрессии иммуногистохимических (ИГХ) маркеров гипоксии: индуцированный гипоксией фактор 1α (Hif-1α), эритропоэтин (EPO) и апоптоза (Caspase-3). С этой целью случайным способом было отобрано 60 плацент: по 15 из 1-й, 2-й, 3-й подгрупп и группы II.
Критерии включения: родоразрешение на сроке 37/0–41/6 неделя гестации, репродуктивный возраст женщины, наличие и доступность медицинской документации; дополнительно для группы I – период реконвалесценции (более 30 дней) после подтвержденной COVID-19 (U07.1) в течение текущей беременности, комплексное лечение COVID-19 в период госпитализации в зависимости от степени тяжести инфекции в соответствии с действующими методическими рекомендациями с последующим продолжением после выписки из госпиталя курса НМГ в профилактических дозах до 6 недель, приема витаминно-минеральных комплексов для беременных, содержащих витамины С, Е, D, в течение всей последующей гестации; дополнительно для группы II – отсутствие COVID-19/респираторных вирусных инфекций в течение текущей беременности, отрицательный результат обследования на SARS-CoV-2 из носоглотки на момент родов. Критерии невключения: со стороны женщины – многоплодная беременность, соматические заболевания в стадии декомпенсации, вирус иммунодефицита человека, злокачественные и психические заболевания; со стороны плода – перинатальная смерть плода/новорожденного, врожденные пороки развития.
Исследование одобрено локальным этическим комитетом Южно-Уральского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 20.09.2021). Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и публикацию его результатов в открытой печати.
Морфологическое исследование плацент осуществляли в Челябинском областном патологоанатомическом бюро, являющемся базой кафедры патологической анатомии и судебной медицины имени профессора В.Л. Коваленко Южно-Уральского государственного медицинского университета. Гистологическое исследование плацент проводили на основе общепринятых методик [13, 14]. Повреждения анализировали с учетом классификации Amsterdam Placenta Workshop Group [14, 15]. ИГХ анализ проводили с применением системы визуализации N-Histofine Simple Stain MAX PO (MULTI, Япония), хромогена DAB и готовых к применению кроличьих моноклональных антител (МАТ) (predilute, ready-to-use). Для исследования процессов гипоксии в плацентарной ткани применяли МАТ к Hif-1α (клон EP118, Epitomics, США) и к эритропоэтину (EPO, Cat. № GTX112834, GeneTex Inc., США). Процессы апоптоза оценивали с использованием МАТ к Caspase-3 (клон ET 1602-39, Hangzhou Human Biotechnology Co., Ltd, Китай). Уровень выраженности реакции на ИГХ маркеры определяли путем измерения площади положительного окрашивания в цитоплазме клеток синцитиотрофобласта. Проводили сканирование каждого микропрепарата с помощью цифрового сканирующего микроскопа Hamamatsu (NanoZoomer S210, Япония). Полученные гистосканы архивировали на цифровом носителе для проведения в дальнейшем автоматизированного подсчета ИГХ-позитивных структур с применением программного обеспечения для цифрового анализа биоизображений QuPath (https://qupath.github.io) [16].
Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета SPSS Statistics 19 (IBM, США). Расчет количественных показателей представлен в формате Ме (Q1; Q3), где Ме – медиана, Q1; Q3 – первый и третий квартили, в связи с отличием их распределения от нормального при анализе с применением критерия Шапиро–Уилка. Статистическую значимость различий оценивали с применением критериев Краскела–Уоллиса, Манна–Уитни. Качественные параметры представляли в виде абсолютных (n) и относительных (%) частот. При анализе таблиц сопряженности использовали критерий
В группах исследования имели место благоприятные перинатальные исходы. Не отмечено статистически значимых различий по частоте развития плацентарной недостаточности (нарушение маточно-плацентарного кровотока 1–2-й степени и/или задержка роста плода) во время беременности – 4/20 (20,0%), 1/30 (3,3%), 4/30 (13,3%), 3/30 (10,0%) случая (р=0,296), дистрессу плода в родах – 1/20 (5,0%), 1/30 (3,3%), 2/30 (6,7%), 0/30 (0,0%) случаев (р=0,703), антропометрическим показателям (вес новорожденного – 3455 (3085; 3750), 3525 (3232; 3812), 3485 (3205; 3907), 3670 (3330; 3825) г (р=0,525); длина новорожденного – 51,5 (51; 53), 52 (50; 53), 53 (50,8; 54), 52 (50,8; 53,3) (р=0,455) см и оценке по шкале Апгар (на первой минуте – 8 (7; 8), 8 (8; 8), 8 (7; 8), 8 (7; 8) (р=0,923); на пятой минуте – 8 (8; 9), 9 (8; 9), 8 (8; 9), 8 (8; 9) баллов (р=0,786)), асфиксии новорожденного – 1/20 (5,0%), 0/30 (0,0%), 1/30 (3,3%), 1/30 (3,3%) случай (р=0,875) в 1–3-й подгруппах группы I и группе II, соответственно. При этом анализ результатов гистологического исследования плацент показал статистически значимое преобладание в 1–3-й подгруппах ряда признаков материнской и фетальной мальперфузии и хронического воспаления в сравнении с группой II.
Децидуальная артериопатия (р=0,011; p1,2=0,556; p1,3=0,904; p1,II=0,021; p2,3=0,598; p2,II=0,001; p3,II=0,005, нижние индексы отражают номера сравниваемых подгрупп/групп) и тромбоз сосудов ворсин (р=0,003; p1,2=0,064; p1,3=0,239; p1,II=0,171; p2,3=0,438; p2,II<0,001; p3,II=0,005) регистрировались статистически значимо чаще в плацентах пациенток 2-й и 3-й подгрупп относительно группы II, между подгруппами группы I статистически значимых различий по частоте децидуальной артериопатии не получено, однако отмечалась тенденция к тромбозу сосудов ворсин во 2-й подгруппе относительно 3-й подгруппы (рис. 1). Агглютинация ворсин (р=0,001; p1,2=0,529; p1,3=0,904; p1,II=0,007; p2,3=0,405; p2,II<0,001; p3,II=0,004) и лимфоплазмоцитарный децидуит (р=0,001; p1,2=0,413; p1,3=0,903; p1,II=0,001; p2,3=0,292; p2,II=0,007; p3,II<0,001) статистически значимо преобладали во всех подгруппах группы I относительно группы II, между 1–3-й подгруппами статистически значимых различий не выявлено (рис. 1). Скопления аваскулярных ворсин наблюдали во 2-й подгруппе статистически значимо чаще относительно группы II (р=0,011; p1,2=0,386; p1,3=0,240; p1,II=0,100; p2,3=0,015; p2,II =0,005; p3,II=0,999), между подгруппами группы I статистически значимых различий не отмечено, но наблюдалась тенденция к увеличению частоты признака во 2-й подгруппе относительно 3-й подгруппы (рис. 1). Массивное отложение перивиллезного фибриноида во 2-й подгруппе отмечали статистически значимо чаще относительно группы II (р=0,021; p1,2=0,105; p1,3=0,248; p1,II=0,322; p2,3=0,598; р2,II=0,004; р3,II=0,018), между подгруппами группы I статистически значимые различия не зарегистрированы (рис. 1).
Нами не выявлено статистически значимых различий в группах исследования относительно синцитиальных узлов (р=0,560), полнокровия межворсинчатого пространства (р=0,139), тромбоза межворсинчатого пространства (р=0,577), гистиоцитарного интервиллузита (р=0,625), некроза трофобласта (р=0,948), нарушения созревания ворсин (р=0,941), отека ворсин (р=0,277), хорангиоза (р=0,374), многоочагового хорангиоматоза (р=0,187), гнойного децидуита (р=0,282), хориоамнионита (р=0,161), некротизирующего хориоамнионита (р=0,249), хориального васкулита (р=0,550), продуктивного виллузита (р=0,020; p1,2=0,908; p1,3=0,059; p1,II=0,029; p2,3=0,028; р2,II=0,012; p3,II=0,739). Инфаркты ворсин не регистрировались.
Проведено углубленное морфологическое исследование плацент для оценки выраженности гипоксического повреждения и активности процессов апоптоза (рис. 2–4). Анализ полученных данных показал наличие статистически значимых различий в группах (табл.).
Регистрировали статистически значимо более высокий уровень реакции на Hif-1α, EPO в плацентах РК после COVID-19 независимо от триместра манифестации инфекции относительно плацент беременных без COVID-19. Уровень реакции на Caspase-3 статистически значимо преобладал в плацентах РК 1-й и 2-й подгрупп относительно группы II.
Анализ полученных результатов гистологического исследования плацент демонстрирует наличие признаков хронической компенсированной плацентарной недостаточности гипоксического, тромботического и воспалительного генеза у РК, причем независимо от триместра манифестации COVID-19.
Наблюдается статистически значимое преобладание в группе РК ряда признаков материнской и фетальной мальперфузии, что частично согласуется с данными других исследований [8–11]. Децидуальная артериопатия и тромбоз сосудов ворсин статистически значимо преобладали в плацентах РК после COVID-19, перенесенной во II и III триместрах, относительно плацент женщин без COVID-19. Агглютинацию ворсин регистрировали статистически значимо чаще в плацентах РК вне зависимости от триместра манифестации COVID-19. В плацентах РК после COVID-19, перенесенной во II триместре, статистически значимо чаще наблюдали скопления аваскулярных ворсин. В плацентах РК чаще регистрировали массивное отложение перивиллезного фибриноида, что согласуется с данными других исследований [8, 9]. Статистически значимые различия по этому признаку получены только между плацентами РК II триместра манифестации COVID-19 и плацентами пациенток без COVID-19 в анамнезе, а в плацентах РК III триместра манифестации COVID-19 наблюдали тенденцию к статистической значимости отличий.
Воспалительные изменения плаценты имели место у всех РК независимо от триметра манифестации COVID-19. Лимфоплазмоцитарный децидуит регистрировали статистически значимо чаще в сравнении с плацентами пациенток без COVID-19 в анамнезе. Продуктивный виллузит выявляли без статистически значимых различий по группам исследования, но в плацентах РК с манифестацией COVID-19 в I и II триместре с тенденцией к статистически значимому преобладанию в сравнении с плацентами пациенток без COVID-19 в анамнезе. Полученные результаты согласуются с данными других авторов [8–10].
Рядом исследований установлено, что SARS-CoV-2 способствует нарушению работы антиоксидантных систем, повышению уровня активных форм кислорода на фоне митохондриальной дисфункции и стимулирует окислительный стресс в тканях пациентов. Последний усиливает продукцию провоспалительных цитокинов, провоцирует цитокиновый шторм, что сопровождается высокой экспрессией Hif-1α, ответственного за адаптацию к тканевой гипоксии и окислительному стрессу [17, 18].
A. Rolfo et al. [19] наблюдали в плацентах пациенток с положительным тестом на SARS-CoV-2 в III триместре в сравнении с плацентами женщин без COVID-19 ультраструктурные изменения в митохондриях. Отмечено статистически значимое повышение экспрессии маркеров окислительного стресса (тиобарбитуровых кислотно-реактивных веществ и Hif-1α), а также активности антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы) при благоприятных акушерских и неонатальных исходах. По данным Е.Е. Воропаевой и соавт. [20], установлен статистически значимо более высокий уровень экспрессии Hif-1α (р<0,001) в плацентах РК после COVID-19 в сравнении с плацентами пациенток с острой COVID-19 и критическим поражением легких при преждевременных родах.
Проведенное нами исследование выявило статистически значимо более высокий уровень выраженности реакции на маркеры гипоксии Hif-1α (р1,II<0,001, р2,II=0,001, р3,II<0,001) и ЕРО (р1,II=0,005, р2,II<0,001, р3,II<0,001) в клетках трофобласта у РК вне зависимости от триместра манифестации COVID-19 в сравнении с плацентами неболевших женщин. Это свидетельствует о сохранении гипоксических повреждений в течение длительного периода после перенесенной инфекции, нарушении плацентарного кровообращения вне зависимости от срока гестации в период острой инфекции, что и подтверждается развитием материнской и фетальной мальперфузии. Также отмечается увеличение уровня выраженности реакции на ЕРО в плацентах пациенток, перенесших COVID-19 во II (р1,2=0,015) и III (р1,3=0,004) триместрах, в 2,2 и 3,5 раза, соответственно, относительно плацент пациенток, перенесших COVID-19 в I триместре. Гипоксию любого генеза относят к факторам, стимулирующим продукцию ЕРО [21, 22]. ЕРО обладает ангиогенным, антиапоптотическим и пролиферативным действием [23, 24]. EPO и его рецепторы выявлены в клетках цито- и синцитиотрофобласта, эндотелиальных клетках фетоплацентарных сосудов, что, предположительно, свидетельствует о влиянии EPO на процессы пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта плаценты [23]. EPO защищает ткани от метаболического стресса [25]. Статистически значимое преобладание уровня выраженности реакции на ЕРО в плацентах РК после манифестации COVID-19 в любом триместре демонстрирует активность антигипоксических и антиапоптотических процессов вне зависимости от срока гестации на момент острой инфекции.
Нами не найдено в доступной литературе сведений об исследовании процессов апоптоза на доношенном сроке в плацентах РК после COVID-19 в сравнении с плацентами женщин без COVID-19 в течение текущей беременности. M.P. Wardhana et al. [26] установили высокую активность апоптоза в трофобласте плацент пациенток, родоразрешенных на фоне острой COVID-19 в III триместре, в сравнении с плацентами беременных без COVID-19. Не было выявлено корреляции между выраженностью апоптоза и степенью тяжести инфекции. Результаты согласуются с данными других авторов, выявивших статистически значимо более высокий уровень апоптоза (р<0,001) в плацентах пациенток с острой COVID-19 в сравнении с плацентами РК после COVID-19, однако это касается только преждевременных родов [20].
Известно, что гипоксия и окислительный стресс являются индуктором активации апоптоза в тканях, в частности в ворсинах плаценты [27]. Воспалительные изменения также инициируют проапоптотический эффект [28]. В нашем исследовании об этом свидетельствует более высокий уровень выраженности реакции на Caspase-3 в плацентах РК при манифестации COVID-19 в любом триместре. Статистически значимо более высокие уровни реакции на Caspase-3 регистрируются в плацентах РК при манифестации COVID-19 во I/II триместре (p1,II=0,001/p2,II[C1] =0,001), с тенденцией к статистически значимому увеличению уровня экспрессии Caspase-3 у РК III триместра манифестации инфекции (р3,II[C2] =0,011) в сравнении с плацентами пациенток без COVID-19. Высокая активность апоптоза в клетках трофобласта может способствовать нарушению процессов ангиогенеза в плаценте, что ведет к неадекватному газообмену и обмену веществ между матерью и плодом, развитию плацентарной недостаточности. Высокий уровень выраженности реакции на Caspase-3 в сочетании с высоким уровнем экспрессии ЕРО в трофобласте плацент РК может указывать на дисбаланс между про- и антиапоптотическими механизмами.
Несмотря на выраженные морфологические изменения в плацентах РК, перинатальные исходы у этих пациенток благоприятны. Можно предположить, что это связано с компенсирующим влиянием лечебных и профилактических мероприятий [12, 18]. Последние включают продленное применение НМГ в профилактических дозах, витаминов C, Е, D.
Острая COVID-19 во II и III триместрах гестации приводит к выраженным плацентарным повреждениям в форме материнской и фетальной мальперфузии, хронических воспалительных изменений, которые регистрируются у реконвалесцентов на доношенном сроке беременности. При манифестации COVID-19 в I триместре эти изменения незначительны. В то же время гипоксическое повреждение, активность апоптоза в плацентах выражены независимо от триместра манифестации COVID-19. Высокий уровень выраженности реакции одновременно и на маркеры гипоксии (Hif-1α, ЕРО), и на маркер апоптоза (Caspase-3) свидетельствует о дисбалансе между проапоптотическими и антиапоптотическими механизмами на фоне хронической плацентарной недостаточности смешанного генеза.