младший научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии (ФГБУ Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Минздрава России)
доктор медицинских наук; ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии (ФГБУ Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Минздрава России)
доктор медицинских наук; заведующая лабораторией патоморфологии и электронной микроскопии (ФГБУ Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Минздрава России)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Гипоксические повреждения миокарда являются одной из первостепенных причин перинатальной заболеваемости и встречаются у 40–70% глубоконедоношенных новорожденных [1]. У детей, родившихся с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ), эти повреждения фиксируются чаще (58%), чем у детей с очень низкой массой тела (ОНМТ) при рождении (46,1%) [2]. Исследования показывают, что гипоксия вызывает целый ряд метаболических и микроциркуляторных изменений миокарда, что в свою очередь приводит к сбоям в сердечном ритме и снижению сократительной функции [3–5]. Основными звеньями морфогенеза хронической гипоксии плода выступают прогрессирующая хроническая плацентарная недостаточность и нарушения кровотока в системе мать–плацента–плод [6–8]. Патоморфологические изменения в миокарде, как правило, представлены нарушением ориентации миофибрилл и исчезновением поперечной исчерченности на фоне венозного застоя и мелкоочаговых периваскулярных кровоизлияний [9].
Сегодня в кардиологии детского возраста широко используются диагностические возможности биохимических маркеров гипоксических повреждений миокарда. Повышение в крови концентрации кардиоспецифических ферментов (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы-1, креатинфосфокиназы, креатинкиназы-МВ, тропонинов I), кардиотропонина Т (cTnT) и миоглобина свидетельствует о деструкции плазмолеммы кардиомиоцитов, что сопровождается высвобождением элементов саркоплазмы, образованием зональных микронекрозов, снижением сократительной функции миокарда [10, 11]. Классическим индикатором необратимых повреждений кардиомиоцитов считается сочетанное снижение тропонинов с миоглобином, способствующее уменьшению энергетического потенциала сократительной способности сердца [12, 13]. Перечисленные выше тропонины, будучи структурными элементами сократительного аппарата гладкомышечных клеток, высвобождаются в кровь вследствие ферментативного разрушения кардиомиоцитов [14–16].
В современных исследованиях показана значительная роль трансформирующего фактора роста (TGF β1) в развитии патологии сердечно-сосудистой системы на разных этапах онтогенеза человека. Изоформа TGF β1, наиболее важная для этой системы, обнаруживается в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов, миофибробластах и макрофагах. При гипоксических повреждениях миокарда TGF β1 стимулирует синтез коллагена и участвует в формировании фиброзных изменений сердца [19, 20].
В настоящее время как в отечественных, так и в зарубежных исследованиях особенности гестационного ремоделирования миокарда и влияние таковых на формирование патологии сердечно-сосудистой системы у глубоконедоношенных детей освещены недостаточно.
Цель данного исследования – выявить морфофункциональные особенности миокарда новорожденных с ЭНМТ и ОНМТ, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.
Исследование, проведенное на базе лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии Ивановского научно-исследовательского института материнства и детства имени В.Н. Городкова, одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 4 от 19.10.2015).
Изучали миокард умерших глубоконедоношенных живорожденных детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию: 25 образцов от новорожденных с ЭНМТ гестационного возраста 22–27 недель 6 дней (1-я группа) и 15 образцов от детей с ОНМТ, родившихся в сроки гестации 28–32 недели 6 дней (2-я группа). Причины смерти детей обеих групп были схожими: нетравматические внутрижелудочковые кровоизлияния III степени (1 группа – 48,0%, n=12; 2 группа - 53,3%, n=8), тяжелая врожденная пневмония (1 группа – 32,0%, n=8; 2 группа - 26,7%, n=3), неонатальный сепсис (1 группа – 8,0%, n=2; 2 группа - 20,0%, n=4). У новорожденных 1 группы в 12,0% случаев (n=3) смерть наступила в результате респираторного дистресс-синдрома.
Для исследования материала применяли морфологические методы, включающие макровизуализацию объекта, органометрию с использованием морфометрических параметров, предложенных Т.Г. Траль и В.Б. Мацкевичем (2010) в качестве эталонных для сердца разных сроков гестации [21], раздельное взвешивание сердца по методу В.Б. Мацкевича (2005) [22], обзорное гистологическое исследование, гистометрию паренхиматозных и интерстициальных элементов миокарда, цитокариометрию, трансмиссионную электронную микроскопию с помощью электронного микроскопа ЭВМ-100 АК (г. Сумы).
Изготовление парафиновых срезов с окрашиванием гематоксилином и эозином проводилось по стандартной методике. Для гисто-, цитокариометрии и определения плотности расположения ядер кардиомиоцитов применялась программа для персонального компьютера «ВидеоТест-Морфология» 4,0 («ВидеоТесТ», Россия). Иммуногистохимические реакции с кроличьими поликлональными антителами к TGFβ1 и cTnT (Biorbyt, Великобритания) ставили при разведении 1:800. С антителами к миоглобину (Biorbyt, Великобритания) использовали разведение 1:50. В качестве системы детекции использовали UltraVision Quanto Detection System HRP (ThermoFisher Scientific, США). Результат оценивали в 100 клетках десяти разных полей зрения микроскопа при ×400 по системе гистологического счета H-score путем вычисления индекса выраженности реакции (ИВР) биомаркера по формуле: ИВР = ΣР(i) × i/100, где i – интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (отрицательная, минимальная, умеренная и максимальная), Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
Цифровой материал обрабатывали статистическими методами при помощи стандартного пакета программного обеспечения Excel 2010 (Microsoft, США) и STATISTICA 6 (StatSoft, США). Предварительно определяли тип распределения вариационного ряда и вычисляли медиану с указанием 25-го и 75-го перцентилей (Ме [Q25; Q75]). Для попарного сравнения различий между вариационными рядами исследуемых групп применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. р<0,05 расценивался как статистически значимый.
В работе задействовались образцы миокарда глубоконедоношенных новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, ассоциированную с материнской патологией и дисфункцией плаценты.
Как правило, матери новорожденных исследуемых групп имели акушерско-гинекологический анамнез, отягощенный медицинским абортом (82,5%), привычным невынашиванием беременности (42,5%), эндометриозом (17,5%), истмико-цервикальной недостаточностью (15%) и соматическими заболеваниями – артериальной гипертензией (22,5%), ожирением (12,5%), аутоиммунным тиреоидитом (7,5%), без достоверных межгрупповых различий по частоте встречаемости таковых. Тем не менее инфекционно-воспалительные заболевания, такие как хронический эндометрит, пиелонефрит, тонзиллит, наиболее часто (р=0,02) диагностировались у матерей 2-й группы – 73,3% (n=11) по сравнению с 1-й – 40% (n=6).
У женщин обеих групп выявлены такие осложнения беременности как хроническая плацентарная недостаточность (92,5%), гестационный сахарный диабет (30%), преэклампсия (45%), преждевременный разрыв плодных оболочек (47,5%), задержка внутриутробного развития плода (32,5%).
Хроническая плацентарная недостаточность в 1-й группе была обусловлена базальным и париетальным децидуитом в сочетании с хроническим виллузитом и нарушениями дифференцировки сосудисто-стромального компонента ворсин (60%, n=15). В плацентах 2-й группы чаще встречались хронические нарушения маточно-плацентарного кровообращения в сочетании с поствоспалительной облитерационной ангиопатией и фиброзом стромы ворсин (53,3%, n=8).
Новорожденные 1-й группы чаще имели гестационный возраст 22–24 недели – 80% (n=20), 2-й группы – 28–30 недель – 40% (n=6). Дети с ЭНМТ чаще, чем новорожденные с ОНМТ (р=0,0152), рождались в тяжелой асфиксии с оценкой по шкале Апгар на первой минуте от 1 до 3 баллов, сохраняющейся на пятой минуте (52%, n=13). Во 2-й группе в состоянии тяжелой асфиксии родились пять детей (33,3%), а сохранение таковой на пятой минуте жизни констатировано у двух новорожденных (13,3%).
У новорожденных 1-й группы в 33,7% случаев (n=8) выявлена задержка внутриутробного развития. Во 2-й группе, соответственно, она наблюдалась в 41,6% случаев (n=6).
По результатам органометрии масса сердца у новорожденных с ОНМТ – 8,7 г (8,0; 9,3) – превышает (p=0,006) аналогичный показатель детей с ЭНМТ – 6,0 г (4,0; 12,0). Прибавка в весе обусловлена не только гестационными изменениями (+33,3%), но еще и гипертрофией правого желудочка (+11,7%), что установлено при раздельном взвешивании сердца (табл. 1).
Гисто- и цитокариометрия образцов миокарда данной локализации у глубоконедоношенных новорожденных гестационного возраста 28–32 недели 6 дней позволила выявить увеличение площади ядер кардиомиоцитов, удельной площади мышечного компонента и снижение площади интерстициальной ткани по сравнению с аналогичными параметрами детей гестационного возраста 22–27 недель 6 дней (табл. 2).
Микроскопически у всех глубоконедоношенных новорожденных выявлены изменения, обусловленные хронической внутриутробной гипоксией: волнообразное деформирование миофибрилл с фокальным некрозом кардиомиоцитов и гемодинамические нарушения на уровне микроциркуляции в виде полнокровия венул, сладжирования эритроцитов в просвете капилляров, мелкоочаговых паравазатов, интерстициального отека (рис. 1, 2). Отек и некроз преимущественно наблюдались в правом желудочке, в частности в папиллярных мышцах и субэндокардиальном слое. У новорожденных с ЭНМТ микроциркуляторные изменения были более распространенными и сопровождались очаговыми нарушениями упорядоченного расположения кардиомиоцитов и эозинофилией.
Для оценки сократительной функции кардиомиоцитов глубоконедоношенных новорожденных было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к сТnТ и миоглобину.
У детей гестационного возраста 22–27 недель 6 дней наблюдалась слабовыраженная реакция на сТnТ в правом желудочке, а в зонах некроза и деструкции мышечных волокон таковая не определялась. ИВР маркера составил 0,9 условной единицы (у.е.) (0,79; 1,05), что ниже (р=0,004) аналогичного параметра детей гестационного возраста 28–32 недели 6 дней – 1,43 у.е. (1,28; 1,62) (рис. 3).
Иммуногистохимическая реакция на миоглобин определялась в виде гранулярных включений в саркоплазме кардиомиоцитов темно-коричневого цвета. У новорожденных с ЭНМТ ИВР был невысоким и составил всего 0,51 у.е. (0,41; 0,56) (рис. 4), тогда как у новорожденных с ОНМТ он оказался еще ниже (p=0,001) – 0,42 у.е. (0,38; 0,45).
Для оценки соединительнотканного компонента желудочков сердца проводилось иммуногистохимическое исследование с антителами к TGF β1. Слабовыраженная иммуногистохимическая реакция визуализирована в интерстициальном компоненте миокарда правого желудочка, фибробластах и эндотелии сосудов микроциркуляторного русла у новорожденных с ЭНМТ. При этом ИВР маркера составил 0,34 у.е. (0,18; 0,54). У детей, родившихся с ОНМТ, констатировано незначительное увеличение реакции на TGF β1 (p=0,001): ИВР составил 0,55 у.е. (0,4; 0,7).
При трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) образцов сердца глубоконедоношенных детей, как правило, определялись следующие особенности: субмембранная локализация ядерного гетерохроматина с его фрагментарными скоплениями в центральных отделах ядра и инвагинаты нуклеолеммы в саркоплазму. В перинуклеарной зоне саркоплазмы кардиомиоцитов у детей с ЭНМТ визуализировались плотно контактирующие между собой поврежденные ультраструктуры – истонченные миофибриллы на фоне отека саркоплазмы и вакуолизированные митохондрии с полуразрушенными кристами (рис. 5), свидетельствующие о дефиците энергетического потенциала. У новорожденных с ОНМТ наблюдались такие изменения как сочетание клазматоза ядра кардиомиоцитов с набуханием и фрагментацией миофибрилл, отсутствие плотных контактов последних с митохондриями, нечеткие контуры Z-дисков (рис. 6), свидетельствующие о нарушении сократительной способности миокарда.
Изучение миокарда глубоконедоношенных детей с применением комплексного морфологического исследования позволило выявить ряд структурных межгрупповых различий.
По результатам органометрии масса сердца у детей 2-й группы оказалась почти в 1,5 раза больше аналога 1-й группы, что не только объясняется гестационным увеличением массы органа, но также может быть связано с гипертрофией правого желудочка, обусловленной нарушением соотношения между интерстициальным и мышечным компонентами миокарда в пользу последнего и компенсаторной гипертрофией ядер кардиомиоцитов [18].
Морфологическая картина гипоксического поражения миокарда глубоконедоношенных детей в наибольшей степени была выражена в правом желудочке. Кроме однотипных изменений (нарушение микрогемоциркуляции, локальные некрозы), обнаружены гестационные различия в виде очаговых нарушений архитектоники миокарда у новорожденных с ЭНМТ и отсутствия таковых у детей с ОНМТ. Подобное структурное различие, вероятно, определяется длительностью и степенью тяжести внутриутробной гипоксии, а также реактивностью миокарда [19] на фоне незавершенной гестационной дифференцировки кардиомиоцитов, подтвержденной результатами трансмиссионной электронной микроскопии.
Иммуногистохимическая оценка сократительной способности кардиомиоцитов позволила констатировать слабовыраженную реакцию на сТnТ и миоглобин у новорожденных обеих групп, что связано с гестационной незрелостью миокарда на фоне гипоксического повреждения. Реакция на TGF β1 в миокарде глубоконедоношенных детей, перенесших внутриутробную гипоксию (невысокая, несмотря на положительную гестационную динамику), обеспечила низкую сократительную способность сердца и возможность развития фиброза миокарда на последующих этапах онтогенеза [20].
Основными морфофункциональными особенностями миокарда новорожденных с экстремально низкой массой тела, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, являются гестационная незрелость и выраженные деструктивные изменения ультраструктур кардиомиоцитов в сочетании со слабой выраженностью реакции на cTnТ, миоглобин и TGF β1. У новорожденных с очень низкой массой тела длительное гипоксическое повреждение миокарда сопровождается гипертрофией правого желудочка, деструктивными изменениями ядер кардиомиоцитов и субтотальной вакуолизацией ультраструктур саркоплазмы, связанными с пролонгированными гемоциркуляторными нарушениями и уменьшением уровня реакции на маркеры сократительной способности миокарда.