Введение

Рентгеновский микроанализ – это метод аналитической электронной микроскопии, который осуществляется с помощью электронного микроскопа. Он основан на генерации характеристических рентгеновских лучей в атомах образца при взаимодействии с падающими электронами пучка. В результате такого взаимодействия генерируются рентгеновские лучи, являющиеся характеристическими, то есть содержащими информацию о том, какие элементы присутствуют в данном образце. Существует множество электронных оболочек и подоболочек, каждая из которых обладает своей определенной энергией, поэтому имеется множество потенциально возможных переходов электронов. Если электрон срывается с K-оболочки, результирующий рентгеновский пик называется К-линией в спектре; если с L-оболочки, то L-линией, и так далее. Кроме того, падающие электроны генерируют фоновые или сплошные рентгеновские лучи. Эти рентгеновские лучи являются тормозными, возникающими из-за взаимодействия падающих первичных электронов с ядром атома.

Как и у любого другого метода, у рентгеновского микроанализа существует минимальный детектируемый порог, определяемый интенсивностью падающих электронов и чувствительностью детектора. Самая низкая концентрация элемента, которую можно обнаружить, составляет порядка нескольких миллимолей на килограмм или несколько сотен частей на миллион, а наименьшее количество элемента составляет порядка 10–18 г. Пространственное разрешение анализа зависит от толщины образца. Наилучший результат достигается в тонких срезах, где, как правило, диаметр анализируемого объема составляет примерно половину толщины среза. При анализе объемных образцов в сканирующем электронном микроскопе пространственное разрешение и минимальная детектируемая концентрация химического элемента зависят от ускоряющего напряжения и состава образца. Типичное значение для анализа лиофилизированного биологического материала при ускоряющем напряжении 20 кВ составляет приблизительно 10 мкм [1].

Скорость и точность анализа с использованием энергодисперсионной спектроскопии в сканирующем электронном микроскопе значительно повысились за последние 10 лет благодаря увеличению отношения сигнал/шум за счет улучшения сбора и обработки сигналов.

Энергодисперсионная спектроскопия может проводиться в трех режимах: анализ химических элементов в точке, распределение элементов по линии и, наконец, анализ распределения по площади, или картирование. Последний режим наиболее интересен, поскольку в каждой точке имеется полный спектр, то есть все присутствующие элементы. Тем не менее программное обеспечение электронных микроскопов не позволяет детально анализировать карты распределения химических элементов.

В настоящее время при анализе различных изображений применяются многочисленные пакеты, в том числе свободно распространяемые. К последним относится и широко используемая научными сотрудниками программа для анализа изображений ImageJ (NIH, США), написанная на языке Java, благодаря чему она является кроссплатформенной, то есть может быть задействована в среде разных операционных систем. Благодаря свободному распространению программы многие пользователи написали к ней различные макросы и плагины, значительно расширяющие ее возможности. Изначально программа была разработана W. Rasband в 1987 году для пользователей Macintosh и называлась NIH Image [2], в 1997 году она была переделана под Java и названа ImageJ [3].

В связи с этим целью исследования являлась разработка алгоритмов применения программы ImageJ для анализа карт распределения химических элементов в шлифах бедренной кости крысы, полученных с помощью энергодисперсионного микроанализа на сканирующем электронном микроскопе JCM-7000 (JEOL, Япония).

Материалы и методы

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 200–250 г. При проведении исследований автор руководствовался положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, а также правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Исследование одобрено комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН (протокол № 515 от 10.06.2019).

Животных под изофлурановым наркозом декапитировали, извлекали бедренную кость и фиксировали в 10% формалине. После обезвоживания в спиртах восходящей концентрации ее высушивали на воздухе при комнатной температуре. Эпифизарно-диафизарную часть кости монтировали на углеродную ленту с помощью цианометакрилатного клея, после чего шлифовали серией абразивной наждачной бумаги (марки 3М до P2500 с размером зерна 3–5 мкм) в продольном направлении до срединной части, используя микропылесос для удаления мелких остатков. Как показало проведение предварительного микроанализа, цианометакрилатный клей не вносит дополнительных химических элементов, кроме углерода и азота. Для снятия электростатического заряда использовали незначительное напыление золотом, которое не детектировалось при анализе.

Подготовленные таким образом образцы (рис. 1 А) анализировали в настольном сканирующем электронном микроскопе JCM-7000, оснащенным энергодисперсионным спектрометром, при ускоряющем напряжении 15 кВ. Карты распределения химических элементов (углерод, кальций, фосфор, сера) регистрировали при накоплении 20 кадров и разрешении 512 × 384 точек (8 или 16 бит на точку). Количественный анализ проводили без применения стандартов с использованием ZAF-коррекции, встроенной в программное обеспечение микроскопа.

Для построения калибровочной кривой внешние стандарты не использовались. Программное обеспечение микроскопа позволяет определять процентное содержание элемента по прямоугольной площади изображения на карте распределения (среднее). Это же изображение использовалось в ImageJ для определения его яркости. Таким образом можно было набрать определенное количество изображений с разными концентрациями кальция и фосфора и построить калибровочную кривую, где определенной концентрации элемента будет соответствовать яркость. В этом случае концентрация элементов может варьировать от 0 до 100%, а яркость – от 0 до 255 градаций (в случае 8-битного изображения).

Статистический анализ и анализ колокализации кальция и фосфора проводили встроенными в программу ImageJ средствами. Для вычисления коэффициентов линейной регрессии использовали Excel (Microsoft, США).

Результаты

Сбор и обработка результатов картирования химических элементов на сканирующем электронном микроскопе JCM-7000 осуществляются с использованием программы SMILE VIEW^™ Lab (JEOL, Япония), однако ее возможности в анализе карт сильно ограничены. Представление результатов концентрации элементов производится с 8-битной (256 градаций) или 16-битной (65 536 градаций) шкалой яркости.

В настоящее время программа ImageJ и ее клон FIJI являются самой распространенной свободной программой для анализа изображений, имеющей более 31 тысячи публикаций в PubMed.

В данной работе использовались 8-битные карты распределения кальция и фосфора, полученные на шлифах эпифизарно-диафизарных частей бедренных костей крыс. На рис. 1 B показано, что концентрация кальция значительно различается в разных участках кости, и это отражается по разной интенсивности яркости на изображении. С помощью макросов можно сегментировать определенные зоны для получения количественных данных по содержанию кальция в этих областях (рис. 1 С). Эти макросы включают в себя сегментирование по уровню яркости, подсчет частиц с ограничением по площади и расчет концентрации в соответствии с полученной калибровкой. Необходимо отметить, что калибровочные кривые должны соответствовать битности изображений: 8-битные калибровки должны использоваться для 8-битных изображений, а 16-битные – для 16-битных изображений. Для сегментирования кальциевых карт распределения использована следующая последовательность операций:

FileèOpenèImageèAdjustèColor ThreshouldèBrightnessèAnalyzeèAnalyze Particlesè (size pixel, show (overlay masks)èResultsèEditèApply Macro (ConcCa.txt)

Результаты, полученные в единицах яркости, в конце преобразовывались коротким макросом в концентрацию:

ConcCa.txt

Conc=0.38*Mean(row*0.1);

StdDevConc=0.38*StdDev(row*0.1);

MinConc=0.38*Min;

MaxConc=0.38*Max;

После сегментирования изображения и выполнения макроса при заданных параметрах выделяются семь областей (рис. 1 С). Интересующую зону можно выделять и вручную, как это представлено на рисунке 1 D, однако сделать это труднее, особенно если она имеет сложную конфигурацию.

На рисунке 2 A представлена калибровочная кривая для 8-битного варианта, где показана зависимость значения яркости от процентной концентрации кальция. Можно видеть линейную зависимость (r=0,996) вида y = 0,3778 × x, где y – концентрация кальция в процентах, а x – уровень яркости, соответствующий этой концентрации. Таким образом, простым перерасчетом можно переходить от яркости на концентрацию (Рис.2 В). Сравнивая результаты ручного и автоматического выделения, можно видеть, что показатели очень близки (рис. 2 C).

Использование плагина колокализации (Colocalization Finder) дает возможность получить данные о взаимной локализации двух химических элементов. Так, например, на рисунках 3 A и B представлены карты распределения фосфора и кальция в шлифе бедренной кости крыс. Композитное изображение распределения фосфора и кальция свидетельствуют о высокой степени наложения обоих химических элементов (рис. 3 С), что наглядно видно на графике рассеяния (рис. 3 D). Можно отметить, что точки группируются вдоль оси под 45°, и это свидетельствует о высокой степени наложения обоих химических элементов. Количественные данные (рис. 3Е) также указывают на прямую связь между распределением фосфора и кальция (коэффициент Пирсона равен 0,929).

Все карты в рентгеновской энергетической спектроскопии регистрируются одновременно точка за точкой, поэтому они являются инцидентными и представлены двумерной матрицей концентрации. Это дает возможность проводить корреляционные исследования распределения различных химических элементов. Одна из ранних работ по обработке изображений в рентгеновском микроанализе появилась в 1989 году [4]. Первые коммерческие анализаторы изображений (IBAS, Kontron, ФРГ) позволили расширить аналитические возможности рентгеновского микроанализа в электронной микроскопии, однако элементные карты регистрировались на фотопленке, что требовало совмещения их при вводе в компьютер через телекамеру. Кроме того, они представляли собой только качественные бинарные изображения, где плотность расположения точек соответствовала большей или меньшей концентрации.

В настоящем исследовании были использованы количественные карты распределения химических элементов, полученные на микроскопе JEOL, JCM-700, оснащенном рентгеновским спектрометром. Программное обеспечение ImageJ позволило реализовать алгоритмы сегментирования изображений для выделения и измерения интересующих областей, а также провести оценку колокализации и корреляции двух карт распределения между собой. Кроме того, использование сторонних программ для обработки карт дает возможность разнести сбор данных и их обработку. Такой же подход был реализован A. LeFurgey et al. [5] в 1991 году. Это дает возможность исследовать микрохимический состав клеток в сфере клеточной физиологии с прицелом на ионную (элементную) компартментализацию, то есть морфофункциональную корреляцию структуры и функции на клеточном и субклеточном уровне.

Схожий с нашим подход был использован K.V. Dahl et al. [6] в 2007 году для построения количественных профилей химических элементов. Авторы использовали данные, полученные из калибровочной кривой для преобразования яркости на элементных картах в концентрацию.

Заключение

Реализация алгоритмов, описанных в статье, при картировании химических элементов методом рентгеновского микроанализа на шлифах костной ткани значительно расширяет возможности программного обеспечения сканирующего электронного микроскопа. Сегментирование рентгеновских изображений элементных карт при этом может быть проведено как в ручном, так и в автоматическом режиме, что делает измерение концентрации в изучаемых областях более точным и быстрым. Больше возможностей при использовании свободного программного обеспечения ImageJ открывается и при корреляционном анализе распределения двух и более химических элементов, а также при анализе их колокализации.

Предлагаемые алгоритмы могут быть использованы для картирования химических элементов не только на шлифах костной ткани, но и на гистологических срезах, подготовленных криогенными методами для сохранения нативного содержания и распределения химических элементов и ионов.