Введение

Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) представляют собой гетерогенную группу злокачественных новообразований системы крови, морфологически проявляющихся инфильтрацией костного мозга опухолевыми клетками (бластами), цитологически напоминающими незрелые кроветворные клетки, экспрессирующие на плазмолемме, в цитоплазме и ядре миелоидные антигены. В практическом здравоохранении дифференциальная диагностика лейкозов основана на оценке принадлежности лейкозных бластов к миелоидной или лимфоидной линии кроветворения при окрашивании мазков периферической крови и аспиратов костного мозга по Романовскому–Гимзе, а также использовании ряда дополнительных методов (цитохимические исследования аспиратов костного мозга, гистологические исследования трепанобиоптатов костного мозга и т.д.). В специализированных онкогематологических центрах для уточнения линейной принадлежности опухолей системы крови проводятся многоцветная проточная цитометрия с флуоресцентно мечеными моноклональными антителами к антигенам опухолевых клеток, а также различные иммуногистохимические исследования [1, 2].

С 2001 года Всемирной организацией здравоохранения в классификацию ОМЛ внедрены генетические критерии. В соответствии с этим варианты ОМЛ с рядом специфических генетических поломок отмечены в Международной классификации болезней 11-го пересмотра, внедрение которой в системе здравоохранения России было временно приостановлено, как отдельные нозологические единицы. В классификации ВОЗ 2022 года выделены два основных типа: ОМЛ со специфическими генетическими аномалиями и ОМЛ по степени дифференцировки клеток. При этом по мере увеличения числа генетических подтипов число ОМЛ, определяемых дифференцировкой, сокращается. Таким образом, наряду с происхождением (фенотип клеток) и доминирующими клиническими признаками характеристика генетических аномалий лейкозных клеток становится одним из ключевых классификационных критериев ОМЛ [3].

Прогностически неблагоприятным подтипом лейкозов со специфическими генетическими аномалиями является ОМЛ с перестройками гена KMT2A, находящегося в локусе 11q23. Характерной особенностью данного подтипа служит, во-первых, внутренняя генетическая гетерогенность: в настоящее время молекулярно-генетическими методами охарактеризовано более 100 вариантов реаранжировок с участием KMT2A. Во-вторых, установлено, что перестройка гена KMT2A выступает генетическим событием, достаточным для развития лейкоза. Тем не менее в силу низкой частоты встречаемости морфологические аспекты ОМЛ у взрослых с мутациями KMT2A описаны недостаточно [4–6].

Цель исследования – охарактеризовать морфологические особенности ОМЛ с реаранжировками гена KMT2A у взрослых пациентов.

Материалы и методы

Работа является ретроспективным исследованием. Объектом анализа были аспираты костного мозга (n=121), полученные в ходе обследования взрослых пациентов с впервые выявленным ОМЛ при толстоигольной биопсии грудины.

Изучение биоматериалов осуществлялось на базе специализированных лабораторий Свердловской областной клинической больницы № 1, Областной детской клинической больницы, Института медицинских клеточных технологий и Уральского государственного медицинского университета в 2020–2024 годах. Во всех случаях для интранозологической верификации выполнялись цитологические, цитохимические, иммунофенотипические, цитогенетические и молекулярно-генетические исследования [3, 7]. Пациенты с острым промиелоцитарным лейкозом, острым лейкозом со смешанным фенотипом, BCR-ABL+ хроническим миелолейкозом, JAK2+ хроническим миелопролиферативным заболеванием в стадии трансформации в острый лейкоз, бластной плазмоцитоидной дендритно-клеточной опухолью из настоящего исследования были исключены.

На первом этапе проводился цитологический анализ с дифференциальным подсчетом не менее 500 клеток в мазках аспирата костного мозга, окрашенных по Романовскому–Гимзе. Цитохимические исследования проб включали постановку реакций на липиды и гликоген. Иммунофенотипирование клеток аспирата проводили цитофлуориметрическим методом для уточнения линейной принадлежности бластов с использованием многоцветного цитофлуориметра. Диагностическая панель включала набор антител к дифференцировочным, миелоидным и лимфоидным маркерам, конъюгированных с флуоресцентными красителями [2, 3].

Стандартное цитогенетическое исследование проводили после предварительного краткосрочного культивирования клеток костного мозга с последующей фиксацией и окрашиванием хромосом (G-banding). Хромосомные мутации описывали в соответствии с актуализированной версией международной системы цитогенетической номенклатуры (International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2020). В случаях неэффективности стандартного метода осуществляли флуоресцентную гибридизацию in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) с зондами на специфические для ОМЛ хромосомные аномалии [7–9]. Для FISH-детекции реаранжировок гена KMT2A использовали набор KMT2A (MLL) Gene Break Apart Probe Detection Kit (Wuhan HealthCare Biotechnology Co, Китай).

Молекулярно-генетическое исследование с целью выявления специфических для ОМЛ транскриптов проведено при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием специально подобранных олигонуклеотидных праймеров к химерным генам BCR-ABL, CBFB-MYH11, DEK-NUP214, KMT2A-AFDN, KMT2A-ELL, KMT2A-MLLT3, PML-RARA, RUNX1-RUNXT1. Амплификация, детекция продуктов реакции и интерпретация результатов проводились с применением специализированного программного обеспечения [7–9].

Все этапы работы соответствовали законодательству Российской Федерации и нормативным документам исследовательских организаций и были одобрены локальным этическим комитетом Института медицинских клеточных технологий (протокол заседания № 2/15 от 17.07.2015).

Клинические сведения были внесены в программу базы данных. Информация о них использовалась для сравнения определенных подгрупп. Анализ распределения проводился онлайн с помощью программных средств веб-сайта www.medstatistic.ru. Статистическую обработку результатов проводили с помощью точного критерия Фишера, χ2 и коэффициента сопряженности Пирсона (С). Доверительные интервалы (ДИ) определяли на основе оценки средних с вероятностью 95%.

Результаты

Наибольшую долю в выборке составили аспираты костного мозга от пациентов пожилого возраста (n=59, 48,8%), значительно меньше было биоматериалов от представителей молодого возраста (n=19, 15,7%), зрелого (n=27, 22,3%) и старческого (n=16, 13,2%). Средний возраст обследуемых был 60,5 года.

Морфологические варианты ОМЛ распределялись в соответствии с франко-американско-британской (French–American–British, FAB) классификацией [2, 3] следующим образом: М0 – 3, М1 – 25, М2 – 68, М4 – 22, М5 – 2, М6 – 1. При иммунофенотипировании наряду с миелоидными маркерами в 17,4% проб (при 95% ДИ от 11,6 до 25,1%) выявлялась коэкспрессия CD7, в 12,4% (при 95% ДИ от 7,7 до 19,5%) – CD56, в 5,8% (при 95% ДИ от 2,8 до 11,5%) – CD22, в 4,1% (при 95% ДИ от 1,8 до 9,3%) – CD19, в 3,3% (при 95% ДИ от 1,3 до 8,2%) – NG2.

Вариант кариотипа лейкозных клеток с использованием G-banding и FISH был установлен в 105 пробах (86,8%, при 95% ДИ от 79,6 до 91,7%). В остальных образцах (13,2%, при 95% ДИ от 8,3 до 20,4%) он остался неуточненным ввиду отсутствия метафазных пластинок и/или низкого качества полученного материала [10]. Преобладающими цитогенетическими вариантами были ОМЛ с аберрантными кариотипами (n=54, 51,4%, при 95% ДИ от 42,0 до 60,8%). Нормальный кариотип лейкозных бластов определялся в 51 образце (48,6%, при 95% ДИ от 39,2 до 58,0%). Специфические хромосомные аномалии выявились в восьми пробах (7,6%, при 95% ДИ от 3,9 до 14,3%), изолированные количественные аберрации – в 14 (13,3%, при 95% ДИ от 8,1 до 21,1%), комплексные аномалии – в 12 (11,4%, при 95% ДИ от 6,7 до 18,9%), хромосомные мутации 5q/-5 или 7q/-7 – в девяти (8,6%, при 95% ДИ от 4,6 до 15,5%), прочие структурные аномалии хромосом – в девяти (8,6%, при 95% ДИ от 4,6 до 15,5%), иные структурные аномалии в сочетании с количественными мутациями хромосом – в двух (1,9%, при 95% ДИ от 0,5 до 6,7%). Кроме того, методом ПЦР химерный транскрипт KMT2A-ELL был обнаружен в аспирате костного мозга при ОМЛ М2 с нормальным кариотипом (1,0%, при 95% ДИ от 0,2 до 5,3%). Таким образом, с учетом выявления криптических мутаций методом ПЦР доля ОМЛ со специфическими аберрациями составила 8,6% (при 95% ДИ от 4,6 до 15,5%), с нормальным кариотипом – 47,6% (при 95% ДИ от 38,3 до 57,1%).

В текущем исследовании было выявлено пять случаев ОМЛ с мутациями в гене KMT2A (4,1%, при 95% ДИ от 1,8 до 9,3%), их основные характеристики представлены в таблице. Анализ данных свидетельствует, что ОМЛ с реаранжировками гена KMT2A гетерогенны по возрастным, морфологическим и генетическим характеристикам.

Лабораторные показатели периферической крови при ОМЛ с аномалиями KMT2A варьировали от лейкопении до гиперлейкоцитоза, содержание бластов – от их отсутствия до субтотальной бластемии. При этом обращает на себя внимание закономерность к корреляции иммунофенотипа ОМЛ CD56+, NG2+, выявленного в двух наблюдениях, с наличием реаранжировок в гене KMT2A (р=0,001, С=0,392), а также случая обнаружения KMT2A+ ОМЛ при редком морфологическом подтипе М0 (р=0,025, С=0,203). Последнее может указывать на кластеризацию хромосомных аномалий в гене KMT2A в зависимости от дифференцировочных и иммунофенотипических характеристик лейкозных клеток [11, 12].

При цитогенетическом исследовании в одном наблюдении (20,0%, при 95% ДИ от 3,6 до 62,5%), при морфологическом варианте ОМЛ М2, реаранжировки KMT2A обнаружены не были, то есть являлись криптическими [10] и определялись только методом ПЦР. И наоборот, в биообразце от пациента с ОМЛ М4 выявленная цитогенетическим методом перестройка KMT2A не была специфицирована при проведении ПЦР (20,0%, при 95% ДИ от 3,6 до 62,5%). Наиболее часто определявшимся химерным транскриптом являлся KMT2A-MLLT3, наблюдаемый в двух образцах при ОМЛ М0 и М1 (40,0%, при 95% ДИ от 11,8 до 76,9%), варианты KMT2A-AFDN и KMT2A-ELL фиксировались каждый в одной пробе (20,0%, при 95% ДИ от 3,6 до 62,5%) при морфологическом варианте ОМЛ М2.

Прогноз ОМЛ с мутациями в гене KMT2A был неблагоприятным. Во всех случаях зафиксированы летальные исходы, обусловленные в основном первичной резистентностью и рецидивами лейкоза в диапазоне от 2 до 10 месяцев, медиана наблюдения составила 8 месяцев.

В одном случае у пациента в возрасте 55 лет ОМЛ с мутацией KMT2A-AFDN манифестировал на 25-м месяце наблюдения острого промиелоцитарного лейкоза в стадии ремиссии. Цитологическая картина поражения костного мозга, результаты стандартного цитогенетического и FISH-исследования представлены на рисунке.

Обсуждение

Реаранжировки в гене KMT2A являются одной из патогенетически значимых аномалий, выявляемых и при ОМЛ, и при некоторых других гемобластозах. Из-за ряда молекулярных, патогенетических и клинических особенностей острые лейкозы с мутациями KMT2A обособлены в качестве отдельных нозологических единиц в классификации ВОЗ для миелоидных, лимфобластных и лейкозов смешанного происхождения. При этом установлена высокая гетерогенность лейкозов с мутациями KMT2A на молекулярном уровне, а также возможность изменения фенотипа опухоли (например, с B-лимфобластного на миелоидный) при отсутствии или наличии минимальных изменений в мутационном статусе лейкозных бластов как на фоне стандартного химиотерапевтического лечения, так и в ответ на инновационную таргетную и CAR-T (chimeric antigen receptor to T-cells, химерный рецептор антигена Т-клеток) терапию [3, 6, 13, 14].

Онкогенез, в частности лейкемогенез, рассматривается как ряд этапов в перестройке клеточных процессов, ведущих к злокачественной трансформации. Тем не менее доказано, что некоторые изолированные перестройки KMT2A сами по себе достаточны для развития лейкозов у экспериментальных животных, так как детерминируемые ими изменения приводят к нарушению транскрипционных программ и появлению способности к самообновлению у мутантных клеток-предшественников гемопоэза [15, 16]. При этом кластерные гены HOXA и MEIS1 считаются ключевыми в развитии лейкоза из-за способности воспроизводить большую часть онкогенных функций KMT2A [15–18].

В ходе некоторых исследований установлена транскриптомная неоднородность ОМЛ с хромосомными мутациями KMT2A, проявляющаяся в существовании нескольких подтипов, коррелирующих с дифференцировочными характеристиками клеток и профилями генной экспрессии [19]. Так, одни исследователи выделяют примитивный и коммитированный фенотипы, различающиеся по преобладающим клеточным сигналам, экспрессируемым антигенам, а также химиочувствительности к определенным таргетным препаратам. При этом коммитированные подтипы сохраняют некоторые признаки миелоидного дифферона, например опухолевых стволовых клеток при них гораздо меньше, чем более дифференцированных потомков [20]. В другом исследовании установлено восемь молекулярных подгрупп ОМЛ (G1–G8) [21], три из которых определены в зависимости от характера экспрессии генов семейства HOX, ассоциированных с KMT2A-позитивными ОМЛ. При этом подгруппа HOX-коммитированных (G6) ОМЛ характеризовалась моноцитоподобными сигнатурами генов. Напротив, HOX-примитивная (G7) и HOX-смешанная (G8) подгруппы характеризовались профилями, более свойственными для стволовых кроветворных клеток. Следовательно, KMT2A+ ОМЛ присущи различные последовательности и тип взаимодействия молекулярных событий, ассоциированных с ними генетических аномалий и профилей клеточной дифференцировки.

В нашем исследовании ОМЛ с реаранжировками гена KMT2A выявлены у 4,1% пациентов в возрасте от 42 лет до 71 года при различных морфологических вариантах с уровнем лейкоцитов в периферической крови от 1480 до 100 690 на 1 мкл, бластемии от 0 до 96%, уровне бластов в костном мозге от 26,8 до 93,8%, что подтверждает его значительную морфологическую гетерогенность. Молекулярно-генетические варианты мутаций включали три разных типа химерых транскриптов и один неспецифицированный вариант, выявленный методом FISH. Во всех случаях течение KMT2A-ассоциированных лейкозов завершилось летальным исходом в сроки, не превышающие 10 месяцев от начала заболевания. Несмотря на ограниченный объем выборки, была выявлена статистически достоверная кластеризация KMT2A+ ОМЛ с иммунофенотипом CD56+, NG2+, а также в подгруппе ОМЛ с минимальной дифференцировкой, что подтверждается в исследованиях других авторов, преимущественно при острых лейкозах у детей [22, 23].

Заключение

Таким образом, несмотря на генетическую и морфологическую гетерогенность, KMT2A+ острые миелоидные лейкозы у взрослых ассоциированы с неблагоприятным прогнозом, что обусловливает необходимость их дальнейшей систематизации для разработки новых лечебных опций, учитывающих клеточное происхождение и генотип-фенотипические ассоциации на основе технологий прецизионного профилирования лейкозных клеток.