Введение

Межклеточное вещество (МКВ) как продукт секреторной активности культивируемых клеток привлекает все большее внимание исследователей [1–3]. МКВ от клеток имеет ряд преимуществ перед тканевым или органным за счет меньшей иммуногенности и риска переноса патогенов [4], а также возможности получения продукта для аутологичной тканевой инженерии [5]. Кроме того, МКВ может быть направленно модифицировано с целью улучшения его свойств для нужд регенеративной медицины и тканевой инженерии [6, 7]. Благодаря длительному культивированию возможно получение значительного количества МКВ, имеющего характеристики, близкие к тем, которыми оно обладает в нативной ткани. Использование таких образцов допустимо как само по себе, так и в составе биоматериалов. Так, 3D-каркасы, полностью состоящие из МКВ, были получены путем децеллюляризации мультислойных клеточных пластов [8] и гранул [9] или путем выращивания клеток и последующей децеллюляризации на вспомогательных материалах, таких как полые трубки/волокна МКВ [10] и губки (пористые каркасы из МКВ) [11]. Эффективность применения таких конструктов подтверждена в ряде доклинических исследований [7].

При подготовке МКВ от клеток как биомедицинского продукта исследователям необходимо оптимизировать ряд параметров: условия культивирования, протоколы децеллюляризации, оценку функциональных свойств клеток после повторного заселения на децеллюляризированные МКВ. В связи с этим становятся весьма востребованы морфологические и морфометрические подходы к оценке состояния их структур. Современные методы микроскопического анализа предоставляют широкие возможности для разработки этих подходов. Рутинно применяемая в клеточно-биологических исследованиях фазово-контрастная микроскопия позволяет получать качественные изображения не только клеток, но и продуцируемого ими МКВ. Этот способ был использован в ряде исследований [12–18]. В работе [19] описаны результаты морфометрии волокон фибронектина, синтезированного фибробластами, отличавшихся по анизотропности. Авторы продемонстрировали корреляцию сложности структуры с величиной анизотропности. В статье [20] показано, что площадь структур МКВ иммортализованных фибробластов, полученных от мышей дикого типа, значимо больше, чем у нокаутированных по гену Hsf1. Применение гистологических красителей дает возможность выявить отдельные компоненты среди волокон МКВ, например окрашенные пикросириусом красным фибриллярные коллагены типа I/III [21, 22].

В данной работе проведен морфометрический анализ фибриллярного компартмента и его коллагенового компонента в МКВ культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека на разных сроках культивирования.

Материалы и методы

Культивирование клеток. В экспериментах использовали МСК из ткани пупочного канатика (МСК-ТПК), предоставленные банком пуповинной крови «КриоЦентр» в рамках договора о сотрудничестве от 18.01.2024 [23]. Клетки культивировали в стандартных условиях в СО2-инкубаторе MCO-5AC (5% СО2, 95% воздуха) (Sanyo, Япония) в полной среде α-MEM (Gibco, Великобритания) с 5% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, CША). Плотность посадки составляла 3×103 кл/cм2. После достижения 70–80% монослоя МСК-ТПК трипсинизировали и рассеивали для экспериментов на культуральные флаконы, предварительно покрытые 0,1% раствором желатина, в плотности 8×103 кл/cм2 (рис. 1 A). После достижения 70–80% монослоя в культуральную среду добавляли 2-фоcфо-L-аcкорбат натрия в концентрации 10 мкг/мл (Fluka, Германия) для стимуляции продукции МКВ (рис. 1 B), после чего культивировали 5, 7 и 10 суток (рис. 1 C). Для визуализации МСК-ТПК образцы в каждой временнóй точке окрашивали 0,5% раствором кристаллического фиолетового (рис. 1 D).

Получение бесклеточных образцов и удаление растворимых компонентов МКВ. После окончания культивирования МСК-ТПК трижды промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФБ) («ПанЭко», Россия), добавляли детергент и инкубировали 5 минут при температуре +37оС. В качестве детергента использовали изоосмотический раствор, содержащий 0,5% Triton X-100 (Sigma-Alrich, США) и 20 mM NH4OH («Самарамедпром», Россия) в ФБ. Процесс децеллюризации контролировали c помощью фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL LED (Leica Microsystems, Германия) (рис. 1 E). Дополнительно полученные препараты окрашивали йодистым пропидием для контроля удаления фрагментов ядер. После децеллюляризации полученные образцы МКВ тщательно промывали раствором ФБ.

Часть образцов МКВ инкубировали в 2М растворе мочевины в 150 мМ растворе NaCl (Thermo Fisher Scientific, США) в течение 48 часов при +4°C для удаления растворимых компонентов МКВ. После экстракции МКВ трижды промывали ФБ (рис. 1 F).

Коллагеновые белки окрашивали 0,1% раствором пикросириуса красного в насыщенной пикриновой кислоте (Sigma-Aldrich, CША) 30 минут при комнатной температуре (рис. 1 G). Затем препараты промывали водой до полного удаления несвязанного красителя.

Микроскопию в светлом поле окрашенных пикросириусом или кристаллическим фиолетовым образцов проводили на микроскопе Leica DM IL (Leica Microsystems, Германия), для фазово-контрастной микроскопии фибриллярных структур использовали микроскоп Nikon Eclipse Ti-U (Nikon, Япония).

Области для анализа структур МКВ выбирали следующим образом. На дно культурального флакона наносили крест-накрест линии, соединяя углы флакона. Далее отмечали на отрезках точки через 1 см, начиная от пересечения линий, и фотографировали изображения в выбранных точках. Такой алгоритм позволил компенсировать неравномерность роста клеток по краям и в центре флакона. Полученные изображения использовали для морфометрического анализа.

Морфометрический анализ проводили с помощью программ Matlab RunTime V9.5 (MathWorks, США) (плагин CT-Fire V3.0 Beta [24]) и ImageJ 1.54f (NIH, США) (плагины OrientationJ [25] и TWOMBLI_v1 [19]). В работе оценивали две группы параметров. Измерение средней длины и ширины волокон, общей длины (на единицу площади) и площади, занимаемой фибриллярными структурами в исследуемой области, позволило охарактеризовать геометрические параметры отдельных волокон. Во вторую группу вошли параметры, определяющие особенности упаковки волокон, включая их количество и число пересечений, сонаправленность, неравномерность заполнения пространства (лакунарность), а также неоднородность структуры (анизотропность). Параметр сонаправленности характеризует положение структур относительно друг друга. Чем выше значение, тем большая доля волокон направлена в одну сторону. Лакунарность характеризует наличие участков разреженности структур МКВ. Чем выше лакунарность, тем больше число и размер участков, лишенных структур МКВ. Неравномерность (анизотропность) отражает неоднородность исследуемого образца, что может коррелировать с количеством исследуемых структур МКВ, а также хаотичностью их расположения. Данные выводились в виде числовых значений исследуемых параметров для каждого изображения отдельно.

Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, США). Данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение (M±SD) трех независимых экспериментов. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост хок-тестом Бонферрони при выбранном уровне значимости p<0,05, с предварительной оценкой нормальности распределения по критерию Колмогорова–Смирнова.

Результаты

К началу эксперимента МСК-ТПК формировали монослой (рис. 2 А). Клеточный пласт выглядел морфологически неоднородным, представляя собой чередование более плотно упакованных участков, в которых клетки не имели четкой ориентации, а также разреженных областей, в которых клетки были более сонаправлены. Такое расположение характерно для культивируемых клеток стромального дифферона и может быть охарактеризовано термином, принятым для культивируемых гладкомышечных клеток, – холмы и долины [26, 27]. При дальнейшем культивировании происходила реорганизация клеточных пластов, связанная с уплотнением МСК-ТПК в холмах (рис. 2 D, G, J). Морфометрический анализ изображений после окрашивания кристаллическим фиолетовым показал, что в начальной точке эксперимента МСК-ТПК занимали около 80% поверхности флакона. После добавления аскорбата натрия, который стимулирует не только продукцию коллагена, но и пролиферацию, площадь, занятая клетками, составила 94% на 5-е и 7-е сутки. К 10-м суткам площадь немного, но достоверно снизилась – до 89%, что могло быть связано с усилением компактизации монослоя, описанной ранее [27].

После децеллюляризации образцы МКВ анализировали с помощью фазового контраста (рис. 2 D, E, H, K), а также в светлом поле после окрашивания пикросириусом красным для визуализации коллагеновых волокон (рис. 2 C, F, I, L). После 3 суток культивирования структуры МКВ были представлены редко расположенными фибриллами (рис. 2 B, C).

Дальнейшее культивирование в присутствии аскорбата натрия привело к значительному увеличению представленности МКВ. На 5-е, 7-е и 10-е сутки в МКВ от МСК-ТПК с помощью фазово-контрастной микроскопии можно было визуализировать общий пул неокрашенных фибриллярных структур (рис. 2 E, H, K), а также коллагеновые волокна после окрашивания пикросириусом красным (рис. 2 F, I, L). Выбранные случайным образом изображения таких фибриллярных структур были использованы для морфометрического анализа.

Для структур МКВ выбраны две группы показателей. Геометрические параметры включали средние длину и ширину волокон, их общую длину и площадь. Вторая группа параметров позволила оценить сложность организации фибриллярного каркаса: определить количество волокон, число точек пересечения и сонаправленность волокон, неравномерность заполнения пространства (лакунарность), а также неоднородность структуры каркаса (анизотропность). Перечисленные параметры были определены для волокон после фазового контрастирования (фазово-контрастные фибриллярные структуры) и окрашенных сириусом красным коллагеновых волокон (табл. 1). Эти же измерения выполнены после экстракции растворимых компонентов МКВ с помощью мочевины (табл. 2).

Геометрические показатели фазово-контрастных фибриллярных структур и коллагеновых волокон не изменялись в процессе культивирования (табл. 1). Анализ сложности структуры не выявил отличий в количестве и сонаправленности фазово-контрастных фибриллярных и коллагеновых волокон в разных временны́х точках. При этом число пересечений фазово-контрастных фибрилл было в два и более раз выше, чем коллагеновых. Лакунарность фазово-контрастных структур во всех временны́х точках была сходной и значимо меньше, чем коллагеновых, что указывало на более равномерное заполнение пространства фазово-контрастными волокнами. Для коллагеновых структур выявлено уменьшение лакунарности и анизотропности в ходе культивирования.

Интересные данные были получены при анализе МКВ после удаления компонентов, растворимых в мочевине (табл. 2). Оказалось, что экстракция мочевиной не повлияла на геометрические параметры фазово-контрастных и коллагеновых структур, а также параметры сложности (табл. 2). Эти наблюдения позволили предположить, что растворимая фракция белков МКВ не оказывает влияния на его структурные свойства, в том числе и механическую функцию.

Как уже упоминалось, при культивировании МСК-ТПК формируют гетерогенные пласты с более плотными (холмы) и разреженными (долины) областями. Для того чтобы определить, как характеристики коллагеновых фибриллярных структур зависят от способа упаковки клеток в пласте, мы сравнили холмы и долины по описанным выше параметрам (табл. 3).

Оказалось, что в долинах были больше общая длина волокон, и занимаемая ими площадь, а также количество волокон и число их пересечений (p<0,05). Коллагеновые структуры в долинах более равномерно заполняли пространство (лакунарность была ниже, чем в холмах), а структура коллагенового каркаса была более однородна (изотропна).

Обсуждение

Нерастворимый компонент секретома МСК − межклеточное вещество, представлено фибриллярными белками, такими как коллагены, эластины, ламинины, а также гликопротеинами и протеогликанами, которые образуют гидрогели, заполняющие пространство между волокнами. Совокупность белков МКВ обеспечивает механическую поддержку клеток и выполняет многообразные регуляторные функции [28–30]. Реализация механических свойств МКВ связана с фибриллярными компонентами, в первую очередь с коллагенами, составляющими основную часть опорных белков, формирующих каркас в тканях и органах. В условиях in vitro фибриллярные компоненты обеспечивают механическую информацию для клеток, модифицируя их поведение. В частности, показано, что жесткость МКВ, регулируемая состоянием фибриллярного компартмента, определяет направление дифференцировки стромальных предшественников, включая наименее коммитированные из них – МСК [31].

При анализе временной динамики изменения структур МКВ мы использовали усредненные показатели без учета гетерогенности упаковки МКВ. При сопоставлении этих наблюдений с тем, что мы обнаружили при анализе МКВ холмов и долин, можно предполагать, что в процессе культивирования МСК-ТПК структуры МКВ претерпевают ремоделирование коллагенового каркаса, приводящее к более упорядоченному изотропному распределению коллагеновых волокон.

Наши наблюдения могут быть интерпретированы с учетом результатов [19]. В этой работе авторы использовали для сравнительного анализа изображения МКВ от фибробластов с изначально отличающимися характеристиками. Часть МКВ являлась в основном изотропной с более тонкими и выровненными волокнами, но вся структура в целом была менее однородной. В анизотропных образцах отмечено увеличение лакунарности, волокна более сонаправлены и имели меньшее число пересечений, чем изотропное МКВ. Такой профиль параметров МКВ соответствовал тому, что мы описали для коллагеновых волокон в холмах, что свидетельствовало о большей анизотропности коллагенового МКВ, тогда как структуры в долинах были более изотропными. Дополнительным подтверждением более высокой анизотропности волокон в холмах служило уменьшение их общей длины и площади волокон, что привело к увеличению лакунарности.

In vivo в нормальных и патологических тканях описаны различные паттерны упаковки МКВ. Известно, что выровненные линейные волокна МКВ обеспечивают сопротивление растяжению в направлении выравнивания, а также помогают направлять миграцию клеток. Переход изотропных изогнутых волокон к более выровненным характерен для агрессивных форм рака [32].

Анизотропность МКВ, полученного из культивируемых клеток, отражает неоднородность расположения волокон (таких, как коллаген) и других структурных компонентов МКВ, которые не ориентированы случайным образом, а выровнены в определенном направлении, что приводит к различиям в жесткости, прочности или других механических свойствах в зависимости от того, в каком направлении они измеряются [33]. В работе [33] проанализировано поведение фибробластов в течение недели после достижения контактного торможения. Авторы продемонстрировали, что выравнивание клеток и, как следствие, МКВ происходило еще до достижения монослоя. При дальнейшем культивировании обнаружено значимое снижение анизотропии, то есть коллагеновый каркас становился более упорядоченным (изотропным). Эти данные хорошо согласуются с нашими наблюдениями относительно увеличения изотропности фибриллярных структур МСК-ТПК, в том числе коллагеновых волокон.

Оценка морфологии является одним из наиболее широко используемых подходов для определения качества клеточного децеллюляризированного МКВ. В нашей работе впервые предложен комплексный подход к количественной характеристике волокон и показана его эффективность для сравнения свойств МКВ в разных экспериментальных условиях. Так, были охарактеризованы особенности МКВ после применения различных протоколов децеллюляризации [18]. В нашей обзорной статье [3] в качестве иллюстраций приведены данные количественной оценки структур МКВ на изображениях, полученных с помощью различных микроскопических методов. Также была описана корреляция высокой жесткости МКВ, которая наблюдается в условиях гипоксии, с повышенной выровненностью волокон и увеличенной анизотропностью [34], что свидетельствует о биомеханических свойствах МКВ.

Заключение

В данной работе мы провели морфометрический анализ фазово-контрастных фибриллярных структур межклеточного вещества, а также коллагеновых волокон от мезенхимальных стромальных клеток на разных сроках культивирования. Мы показали, что при длительном культивировании клеток, достигших контактного торможения, не происходит изменения геометрических параметров фибриллярных структур межклеточного вещества, однако снижается лакунарность и анизотропность, в том числе основной составляющей – коллагеновых волокон. Анализ влияния характера упаковки фибриллярных структур межклеточного вещества на состав и свойства гликопротеинов и протеогликанов растворимой части представляет интерес с точки зрения регенеративной медицины для создания тканеинженерных конструктов.