Получение поликлональных антител к AL-каппа легкой цепи амилоидного белка
Аннотация
Введение. Классификация амилоидозов основана на белке-предшественнике, который образует амилоидные фибриллы, и распределении амилоидного отложения – системном или локализованном. Наиболее частой формой системного амилоидоза является AL-амилоидоз, при котором амилоидогенный белок состоит из полноразмерных лямбда или каппа легких цепей иммуноглобулина либо их фрагментов. В отличие от других типов амилоидоза AL-амилоидоз трудно классифицировать иммуногистохимическим методом, так как каждый пациент с этим заболеванием обладает индивидуальной последовательностью аминокислот в вариабельном регионе легких цепей и использование стандартного набора антител не всегда дает достоверный результат. Цель работы – получение поликлональных антител к пептидным эпитопам вариабельного и константного регионов каппа легких цепей амилоидного белка.
Материалы и методы. Информационный поиск и анализ пяти субклассов амилоидогенных каппа легких цепей иммуноглобулина был проведен с использованием базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США) и сведений литературы. Найденные аминокислотные последовательности обрабатывали в программе Tcoffe Regular. Вторичную структуру белка анализировали по методу J.M. Parker et al. (1986) с использованием программного обеспечения Peptide Companion software (CoshiSoft/PeptiSearch, США). После выбора аминокислотных последовательностей проводили синтез двух полипептидов и их очистку методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Для получения поликлональных пептидных антител кроликов новозеландской породы иммунизировали синтетическими пептидами по стандартизированному протоколу (Pineda Antibody-Service, Германия). Сыворотку крови для исследования брали на 60-й и 100-й дни после начала иммунизации, ее эффективность тестировали методом дот-блоттинга. Фракцию IgG выделяли методом аффинной хроматографии на колонке Hi Trap Protein G HP (Amersham Biosciences AB, Германия).
Результаты. Анализ 112 аминокислотных последовательностей каппа легких цепей показал, что самым распространенным является субкласс I (87 наблюдений), использованный для составления гипотетической аминокислотной цепи. Первый антигенный эпитоп был выбран из наиболее часто встречающихся аминокислотных остатков вариабельного региона гипотетической цепи и соответствовал аминокислотным позициям 3–17 (QMTQSPSSLSASVGD). Константный регион у всех пяти субклассов был одинаковым, и в качестве второго эпитопа использовали участок, соответствующий аминокислотным позициям 116–130 (FIFPPSDEQLKSGTA). Синтезированные пептиды NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH2 и NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2 были очищены методом HPLC (до 86% и 89%, соответственно) и применены для иммунизации. Успешность ее была доказана методом дот-блоттинга, с использованием синтезированных пептидов в качестве позитивного контроля. Выделенные из сыворотки крови IgG антитела давали положительную реакцию с амилоидом во всех случаях AL-каппа амилоидоза и отрицательную – при AL-лямбда, АА- и транстирретиновом амилоидозе.
Заключение. Нами получены четыре новых поликлональных антитела, направленных к полипептидам NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH2 (AK1 и AK2) и NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2 (AK3 и AK4) вариабельного и константного регионов каппа легкой цепи имуноглобулина. Данные антитела могут быть рекомендованы для иммуногистохимического типирования амилоидоза в разных органах и тканях с целью уточнения диагностики AL-каппа амилоидоза.
Ключевые слова: амилоидоз, AL-каппа амилоидоз, антитела, дот-блоттинг, иммуногистохимическое исследование.
